熒光共定位分析是對細胞中兩種帶有熒光標記的蛋白、細胞器或者藥物、納米材料等之間的空間相互位置關系進行分析，以確定它們是否定位于同一區域或存在相關性，在細胞生物學、藥理學、醫學、植物學等研究領域具有廣泛的應用。 

*直觀*簡單的共定位分析就是直接看不同顏色的熒光之間是否重疊，比如蛋白A標有綠色熒光，蛋白B標有紅色熒光，如果蛋白A和B共定位則綠色紅色疊加顯示為黃色（圖1）。只是這種方式無法提供準確的定量結果，已無法滿足科研工作者越來越高的要求。所以我們需要可以提供量化結果的更專業的共定位分析。

圖1. 綠色熒光標記的蛋白A（左）；紅色熒光標記蛋白B（中）；A和B位置重疊，熒光顯示黃色（右）

 1  進入Quantify

 2  在Tools中選擇Colocalization

共定位分析是對兩個熒光通道之間進行分析，所以對于通道數多于兩個通道的數據，需要先確定分析哪兩個，把暫不分析的通道點灰，即可得到共定位結果及散點圖。

 3  Statistics里面即顯示共定位分析結果：Pearson's Correlation，Overlap Coefficient，Colocalization Rate等。既可以對整張圖進行分析，也可以使用區域選擇工具圈出感興趣區域ROI進行分析。

 4  Parameters 為了得到更準確的結果，可以進行相關的參數設置。

共定位結果的精準度與圖像的分辨率密切相關。但由于衍射極限的存在，常規共聚焦光學分辨率只有200nm左右，如果是觀察大于200nm的結構當然輕松，也很容易就能準確判斷其共定位程度，但細胞內的亞細胞器、蛋白結構等尺寸往往更小，我們如果需求更精準的結果就需要選擇與之匹配的*高分辨率成像技術：如達到120nm的高分辨率LIGHTNING技術，達到30~50nm的*高分辨率STED技術（圖2）等。隨著分辨率的提高我們可以看到的結構越來越精細，得到的共定位結果當然越來越準確。所以在進行共定位實驗時我們可以盡量選擇更高分辨率的成像方式。

圖2. 分辨率對共定位的影響，STED成像和普通共聚焦成像

此外在樣品準備和采圖時：

1) 串色會嚴重干擾到共定位結果的準確性，所以實驗時可盡量選擇串色較少的染料組合以避免串色帶來的干擾；如果選擇的染料串色，采圖時也可以優化調節檢測范圍以排除串色干擾，當然也可以使用序列掃描的方式。

2) 采圖時盡量選擇高數值孔徑的物鏡以獲取*優分辨率，同時注意采樣頻率需要滿足Nyquist采樣定理（可通過Optimize xy-Format功能來調節format實現），從而得到與*優分辨率匹配的pixel size，以避免采樣頻率不足導致的信息丟失，以及采樣頻率過高可能引起的光漂白。

3) 采圖時確保各熒光通道不過曝，盡量獲取信噪比好的圖像。優異的原始數據是后期定量分析和去卷積處理的*佳保障。

4) 采圖后可進行去卷積處理（如Huygens或者HyVolution中的deconvolution）以獲取信噪比、分辨率更好的數據，得到更準確的共定位分析結果。

5) 共定位分析有多種分析算法，如Pearson's Correlation，Overlap Coefficient，Colocalization Rate等，每種算法都有各自的特點和*佳適用情況，所以我們需要根據具體情況來選擇，或者采用結合多種算法結果來分析^{【1】【2】【3】}。

*后，祝大家可以輕松愉快地做好共定位分析實驗啦。