隨著技術的發展，在*高分辨率顯微成像技術的使用上，科學家已經不滿足于只觀察固定細胞或組織的亞細胞器*微結構，活細胞*微結構的動態*高分辨率追蹤由于可以提供常規顯微鏡下無法觀察到的更接近自然狀態的微觀變化，日益成為研究人員競相涉足的領域。

STED (Stimulated emission depletion, 受激發射損耗) *高分辨率成像是純光學意義上的*高分辨率技術，成像過程只需打開 STED 激光而無需后期計算，就可以快速得到*高分辨率圖像。因此在活細胞動態*高分辨成像方面，相比其他的*高分辨率技術，STED 存在先天的優勢。

▲ 圖 1. 多色*高分辨率顯微成像：3 個 STED通道 + 1 個共聚焦通道。

STED：Alexa 647-波形蛋白 (紅色)、Alexa 594 -α 微管蛋白 (綠色)、Alexa 488-微絲 (青綠色)。共聚焦：DAPI-DNA (藍色)。致謝：Eugene Katrukha，荷蘭烏特勒支大學

有機染料的開發

眾所周知，*高分辨率成像技術 (包括 STED) 都需要將目標結構標記上熒光比較強且光穩定性好的染料，特別是活細胞*高分辨率成像就更是如此。傳統的活細胞成像方法主要是通過在細胞中轉染熒光蛋白而實現。相比之下，有機染料比熒光蛋白更有優勢，因為它們能產生比熒光蛋白高幾個數量級的光子，從而在成像時能達到更好的分辨率。但是，能和 STED 成像匹配的活細胞有機染料并不多，因為大多數的有機染料都不能透過細胞膜和活細胞內的結構特異性結合。    

SiR 染料 (硅羅丹明) 的發現使 STED 活細胞成像向前推進了一大步。這種染料可輕松穿透細胞膜進入細胞，并且熒光亮度和穩定性都非常好。SiR的化學結構和光譜性能如圖2，激發峰在 650 nm, 使用 775 nm 波長作為損耗光即可做 STED 成像。因為具備近紅外染料的特性，SiR染色可以在更低的損耗激光能量之下得到更好的分辨率。目前，市場上已經有商品化的 SiR-Tubulin 和 SiR-actin, 直接加入活細胞中，就可以實時采集到細胞內微絲和微管的*高分辨率圖像。

▲ 圖 2. SiR的化學結構和光譜

雙色*高分辨率成像標記

這樣僅是較好的解決了單色活細胞 STED 成像的問題。如果需要跟蹤活細胞內多種組分的變化及其相互作用就需要面臨多色標記的困難。SNAP-TAG 和 HALO-TAG 的方法很好的解決了這個問題。

SNAP-TAG 是一種經過改造后的DNA修復酶，可以特異性和它的底物BG (benzyl guanine芐基鳥嘌呤) 結合，如果將這種DNA修復酶的基因和目標蛋白的基因融合并轉到細胞內，那么在細胞內加入標記了熒光的底物就可以看到細胞內目標蛋白的熒光。HALO-TAG也是類似的原理，只不過HALO-TAG的底物是CA (chloroalkane 氯烷烴)。

▲ 圖 3. SNAP-TAG示意圖

研究者們通過這種標記工具SNAP-TAG -SiR和HALO-TAG-ATTO590分別標記活細胞中的線粒體和內質網，并使用*高分辨顯微鏡（STED）觀察了這兩種細胞器中不同蛋白的相互關系和動態變化（如下圖4），2秒/張的頻率拍攝100張圖片后，熒光亮度仍然保持不變。可以觀察到線粒體和內質網融合的整個過程，如視頻1和視頻2。

▲ 圖 4. STED納米顯微鏡下內質網與線粒體的相互關系

▲ 視頻 1. COS7活細胞線粒體和內質網成像，Scale bar = 2 μm

視頻 2. 內質網小管收縮可能形成線粒體的動態過程，Scale bar = 500 nm

優勢

首先，SNAP-TAG -SiR和HALO-TAG-ATTO590雙色活細胞標記系統亮度高、光穩定性好，容易透過細胞膜在不影響細胞正常生理狀態的前提下進行SiR和ATTO590雙色標記；其次，這兩個染料可以用相同的損耗激光采集STED圖像，大大加快了圖像的采集速度，能夠完全滿足多色、快速、活細胞動態*高分辨率成像的要求。

近幾年來，隨著STED技術的發展，科學工作者也不斷開發出可以用于STED活細胞成像的染料和熒光蛋白，相信在不久的將來會有更多的活細胞STED標記工具供研究者選擇，并達到更高的分辨率，得到*越前人的實驗結果，實現STED成像領域的更大突破。