尼康顯微鏡三色帶通激發塊

包括在尼康三色波段激發熒光激發塊組合是兩個各自包含三個帶通發射區能夠通過藍色，綠色，黃色，橙色的窄波段，和紅光譜區有選擇地分離出熒光發射小心平衡組合。 此交互式教程探索的變化而激發和發射激發塊的光譜分布，以及那些的多色鏡子，如何影響在設計用于乘法標記的熒光團在三色激發組合信號電平，光譜交叉，整體過濾性能，并且圖像對比度紫外線，藍色和綠色區域。

教程初始化與隨機選擇的熒光檢體中出現的標本圖像窗口和紫外線藍綠三帶通激發塊激發組合（DAPI-FITC-TRITC;默認）上的過濾器集譜概況圖形顯示頻譜輪廓。 熒光的吸收和發射光譜截面（帶過濾器的傳輸通帶重疊區域）可以選擇在光譜截面標題中列出相應的復選框（ 吸收或發射 ）單獨或集體觀看。 當一個或多個復選框被激活，將合并的過濾器的透射和反射光譜疊加在所選擇的熒光團（多個）使用以標記樣品（熒光光譜圖中不包括對自身熒光植物標本）的吸收光譜和發射光譜。 熒光團的吸收光譜示于使用棕色填充的教程，而相應的發射光譜表示用灰色填充。 由過濾器設置滑塊顯示過濾器組合波長特性，顯示在本教程中下部的黑色方形框。 這些值被不斷地更新作為滑塊被翻譯從左至右。

為了操作教程，使用過濾器設置滑塊可供三頻激發兩個過濾器組合之間進行轉換。 當滑塊從左至右翻譯，激發和阻擋濾光片的光譜分布，以及該多色鏡，被修飾以模擬變化的光譜分布。需要注意的是連續變化的光譜圖并不暗示任何激發塊的組合是可能的，也不是單獨的過濾器設置可變（沒有物理地更換過濾器）的問候的光譜分布。 的選定的過濾器套之間的頻譜輪廓的變化被簡單地用于幫助建立在每個光學塊中使用的過濾器的組合之間的關系。

個別過濾光譜 （激發，發射和多色反光鏡）可以通過選擇或取消相應的復選框的下面圖中添加或刪除過濾器設置光譜曲線圖。 此外，該熒光團的吸收光譜和發射光譜可以被添加或與一組類似的復選框（ 頻譜截面 ）除去。 檢體圖像同時改變與過濾器配置文件以反映變化由改變通過所述滑塊的平移產生的過濾器的組合產生的對比度和信號電平。 新的標本可以在任何時候選擇使用選擇的樣本下拉菜單，用來標記選定樣本的熒光直接列出的菜單框的下方。 在所有的情況下，將樣品粘有兩個或更多熒光探針展示熒光的具有窄的和寬的通帶阻（發射）過濾套的選擇性分離。

尼康顯微鏡三色波段熒光集被主要設計用于與特定的三熒光套件最佳性能，盡管它們都同樣有效用具有類似的吸收和發射光譜曲線候補探針組合。 利用精確的波段選擇，具有反射和透射區之間的陡峭的帶通轉換，多重激發和發射信號分離以最小的干擾。 為了保持三個單獨的熒光信號波段，這些專門的過濾器組還包含二色鏡具有多個帶通特性，其具有互補于所采用的具體的激發和發射激發塊的傳輸和反射區域。 每個尼康三波段熒光集優化結合DAPI和FITC（異硫氰酸熒光素）與使用或者TRITC（異硫氰酸四甲），或得克薩斯州紅探頭。 對應于這些熒光染料的組合相關的頻譜區的范圍從紫色激發和發射藍色到綠色的激發和紅色發光。

尼康DAPI-FITC-TRITC三色波段激發塊組合結合有一個通帶為紫色區域的激發（385?400納米），連接到一個帶通發射（屏障）過濾器發射藍色熒光（450到465納米）在其第一激發濾光片（最短波長）信號帶。 第二個激發 - 發射波長組合，此過濾器集允許藍色激發在475至490納米的窄帶和檢測所產生的綠色熒光，在505至535納米范圍內。 第三熒光信號由綠色區域激發（545至565納米），其導致橙紅色發光，在580至620納米的波長范圍內檢測產生的。這套三聯熒光帶提供最佳的同時檢測DAPI，FITC和TRITC，專門針對不同的細胞成分; DAPI - Alexa Fluor 488 - MitoTracker Red CMXRos熒光組合是適合這個過濾器設置為好，該Alexa Fluor 488和MitoTracker Red CMXRos光譜曲線那些FITC和TRITC的相似性。

在三色激發激發塊塊，與在其他的多波段套，二色反射鏡的設計是至關重要的多個熒光信號的分離，允許其檢測具有最小交叉（光譜bleedthrough）和噪音。 與此相反的長通分光鏡常常在傳統的過濾器組合使用時，多波段套采用二色反射鏡與被精確地定位相對于所述多個激發和發射波段的帶通數的區域。 典型地，第一（下部）切割上的反射鏡被定位僅僅幾納米上述短波長激發峰，開始一個傳輸波段完全圍繞相應的發光峰值波長的值，接著是陡峭的透射截止，這允許第二激發帶的反射。 在剛剛比第二激發帶更高的指定波長，反射鏡使另一個尖銳過渡到與所述第二發射帶通相對應的發送區域。 在三頻段激發塊組，該發送反射圖案被重復一次的第三信號通道。 在DAPI-FITC-TRITC組合使用二色鏡具有適當地位于相對于各個激發和發射激發塊互補的多個帶通透射區域。 切的波長出現在435，500，和570納米。（奧林巴斯顯微鏡）

薄膜干涉技術中的多波段激發塊組的制造中的應用使得有可能平衡的兩個（或更多）的熒光染料，以提供最佳的成像特性的熒光信號水平。 在許多過濾器的組合，所述短波長激發峰的傳輸特性文件的尺寸減小，以平衡兩個或三個發射信號，以及以最小化光漂白和標本的損傷。這是在套設計用于與一種熒光團激發的紫光或紫外光譜區，使用特別重要的是由于較短的波長的高激發效率。 短波長激發峰的顯著降低強度示于兩個尼康三頻組合的透射光譜。 它也可以注意到通過檢查某些部件是通用的，以一個以上的過濾器塊中的過濾器組透射光譜。 例如，雙波段FITC-Texas Red和三色波段DAPI-FITC-Texas Red套利用相同的二色鏡和發射濾光片，只是在不同的激發激發塊組件，其中第三個短波通帶被添加為DAPI激發在三聯集。

同時檢測DAPI，FITC和德克薩斯紅（或類似的光譜熒光團），可以很容易地實現與尼康DAPI-FITC-Texas Red三色激發帶通激發塊組合。 紫色激，藍色發射激發塊波段，和藍色激發綠色發射帶（對應于DAPI和FITC，分別）具有類似的特性對于與DAPI-FITC-TRITC集，雖然有輕微的修改與更好的集成德克薩斯紅，綠的激發的紅色發光的光譜特性發生在較高波長相比TRITC。 在這一組中使用的激發濾光片具有395至410納米（紫色激發）聯接到450至470納米的發射（阻擋）激發塊的通帶（藍色發光），這是適合于DAPI和類似的熒光團1帶通區域。激發塊組的第二波段提供激發在490至505納米的藍色波長范圍內，并且檢測在515和545納米之間的范圍中相應的綠色發光的（用于FITC和類似的熒光染料）。 對于德克薩斯紅熒光優化信道具有560至580納米（綠色激發），耦合到一個發射帶在600至650納米的紅色光譜區域中的激發范圍。

奧林巴斯顯微鏡雖然對于DAPI，FITC和德克薩斯紅熒光團的三色聯合優化，探針具有相似的吸收和發射光譜特性也可以使用與此過濾器集。 相比，DAPI-FITC-Texas Red塊，產生出現更多的橙******調圖像中的DAPI-FITC-TRITC塊，其中有一個紅色發射通帶錯開15納米到較低的波長。 該二色鏡（分束器），在DAPI-FITC-Texas Red濾光片組合的帶通區域的戰略位置處的445，510，和590納米的截止點的波長與激發和發射激發塊窗口來對應。 規格為二色鏡和濾光片的兩個尼康三色波段激發塊的組合列于表1。

• DAPI-FITC-TRITC -的DAPI-FITC-TRITC激發塊組合被設計成用于同時從具有類似的光譜特性的熒光染料DAPI，FITC和TRITC或其他探針組合檢測發射。 三個狹窄的激發和發射譜帶對應紫色激發特定區域與相應的橙紅色發光藍色發光，藍色激發耦合到綠色排放，綠色激發。

• DAPI-FITC-Texas Red -時相比，標準的DAPI-FITC-TRITC集綠色發射， -該DAPI-FITC-Texas Red濾光片組合的設計稍有不同的通帶區域為紫色激發-藍色發射，以及用于藍色激發。 這種設計是為了更好地與必要的得克薩斯紅更高的激發和發射波長，相對于對于TRITC的值符合。 多帶通地區的用戶提供最佳的檢測，以最小的交叉和噪音，為DAPI，FITC同時可視化和德克薩斯紅，或類似的光譜熒光組合。