徠卡顯微鏡在核孔復合組織提出了新的見解

核孔復合物 （NPC）在核膜一個大的蛋白質復合物，表示其柵極連接到所述真核基因構成。 這種復雜的由幾百形成為注定要進入或離開核化合物的選擇性柵極蛋白質。

正因為如此出色的功能NPC的結構是極大的興趣。 到目前為止，全國人大結構分析已主要限于結晶研究或電子顯微鏡（EM）。 單組分的幾種結構已經被破譯通過晶體學。 然而，復雜的內各個蛋白質的組織仍然難以捉摸。 一個間隙現已關閉通過使用超分辨率顯微鏡。

揚Ellenberg和他的科學家團隊在EMBL海德堡已經獲得了新的見解的NPC結構的徠卡顯微鏡基態損耗（GSD）的幫助。

安娜·辛波絲卡最近公布的這項研究的科學文章中的結果“核孔支架結構由超分辨率顯微鏡和粒子平均分析”和她的成就的意見和基態損耗顯微鏡的蛋白復合物的分析在隨后的采訪中的潛力。

什么是GSDIM方法的研究優勢？

在我們的研究中，我們試圖了解大型多蛋白復合物，如核孔復合物（NPC），都建立。 因為它們的尺寸和復雜性，例如分子機器都超出了單個方法的范圍和長期以來一直用于結構生物學的一個挑戰。 原子分辨率的方法，例如X射線晶體學或核磁共振需要純化的樣品，并且不適合于非常大的集。 雖然，電子顯微鏡可以觀察大復合體在其天然環境中的細胞，它往往是很困難的分配的電子密度，以個別蛋白質。 在熒光顯微鏡中的蛋白質的身份是已知的，超分辨率（SR）現在讓我們來可視化低于衍射極限的細節。 當SR被結合的顆粒平均，蛋白'位置可以被映射到一個亞納米精度，一個尺度，使得適用于大型復合結構的研究光鏡。 因此SR顯微鏡可以連接不同類型的數據，最終幫助生成的多蛋白組件偽原子模型。 此外，特別是GSDIM等本地化SR方法的一大優勢是，他們使用比較簡單，并定期讓蛋白，是10-20納米相隔的分辨率。 這對我們來說很重要，因為我們能夠獲得大的數據集，并期待在許多不同的標記在一個相對有效的方式。

什么是新的洞察它給了你關于核孔復合體的結構？ 你去過哪些細節能夠看到第一次？

Nucleoporins是建立核孔（見圖1）的蛋白質。 首次，SR顯微鏡使得有可能解決的幾個這些蛋白質的組織中的環周圍的人大。 平均數千這些環允許我們測量不同nucleoporins的位置相對于所述孔的與亞納米精度的中心.然后我們可以系統地進行比較，構成所謂Nup107-160 subcomplex，這是人大最大積木和孔的結構骨架的主要組成部分nucleoporins的徑向位置。

圖1：一個U2OS細胞標記抗核孔蛋白Nup133的抗體和綴合的Alexa Fluor沿著傳輸軸線觀察647.個別的NPC的二次抗體的核的底面是作為環狀結構可見。 比例尺：3微米。

如何將我們的核孔復合物的認識已經被現在修改？

在我們最近的研究中，我們提供的位置限制為Nup107-160 subcomplex的成員和在此基礎上的數據，我們能夠解決一個長期存在的爭論在該領域：本subcomplex的取向的問題相對于所述傳輸軸。 這是理解如何NPC的結構支架的組織又邁進了一步。 我們希望，在未來，我們將能夠映射毛孔所有蛋白質，并提供這一重要運輸機的全面的結構模型。

請描述您剛剛開發用于組合數千超分辨率顯微鏡圖像，達到低于1納米精密的方法。

雖然SR顯微鏡讓我們想象周圍的NPC中心nucleoporins的組織，這些圖像的原始分辨率將不足以直接看到相同的subcomplex個別蛋白質之間的微小差異。 因此，我們開發了一種分析方法，其中，染色用特定的標記個別的NPC的許多圖像在空間中仔細對齊的孔的中心，或者在標記的第二信道的參考蛋白質的位置，然后被相加，以產生的平均圖像（見圖2）。 由于我們使用幾千相同的結構的圖像，該注冊過程是非常精確的。 我們隨后能夠通過用適當的數學模型擬合平均信號，以確定的熒光標記物的位置。 重要的是，我們發現，這個平均化過程的精度在很大程度上取決于對原始數據的質量在一定程度上。 為了使我們的測量不同的蛋白和實驗之間絕對的可比性和消除低質量的染色潛在的文物，我們實現了一個自動分析的管道控制參數，如定位精度和密度。 關于生產的統計學顯著數據，我們可以在從GSDIM方法的可靠性和堅固性和有效的漂移補償（SUMO）階段加成益處。

圖2：平均過程示例結果。 （A）的NPC的圖像標記對Nup96抗體（高斯濾波）。 （B）NPC的平均圖像用針對Nup96抗體通過比對和8000圖像各個毛孔的總結產生。 （三）各地人大的中心上Nup96熒光標記，從平均圖像的輪廓確定的平均位置。 比例尺：0.1微米。

總而言之，我們的方法是通用的，并允許確定該熒光標記的位置相對于中心對稱結構的或具有亞納米精度和精度的參照蛋白質。 應用這種方法的核孔的幾個不同的蛋白質，我們可以相對于所述結構的中心分配它們的相對位置。 此信息使我們能夠確定在NPC支架單個subcomplex的方向（見圖3）。

圖3：應用的平均化過程在Nup107-160 subcomplex（由不同顏色描繪）的幾個表位，它們的相對位置可被確定。 染色通過使用GFP融合蛋白的納米抗體的標簽來實現。 位置信息是與覆蓋全國的細胞質環的EM結構。 電子密度圖禮貌O. Medalia教授

什么是要克服用于制備超分辨率的樣品的一般障礙？ 你使用這個研究，標記？

當工作在這個項目中，我們意識到，獲得最佳的熒光標記是在一個SR實驗中最關鍵的步驟和超分辨率方法一般需要更高質量的樣本比傳統的顯微鏡。 盡管幾個方面的樣品制備的，如低背景和良好的結構保存，是重要的，這兩個最重要的限制因素在我們的情況下是標記試劑的大小，和可實現的標簽密度。 最初我們使用間接免疫熒光用抗核孔蛋白的抗體，這使得內源性蛋白在細胞中的特異性標記。 然而，使用的抗體的一個主要問題是它們的大小 - 它們可以通過最多為15nm可能抵消從目標表位的熒光團。 此外，我們的平均方法需要具有高密度的標簽樣本。 這僅是可實現具有非常高的親和力的抗體和我們只能夠獲得這樣的試劑，用于我們感興趣的，我們通過表達nucleoporins作為GFP融合蛋白和染色的樣品的熒光小解決這兩個問題的nucleoporins的一個子集標記的抗GFP納米抗體,這是只有十分之一的常規IgG的大小，從而減少了潛在的一半以上的偏移。 重要的是，這個標簽是由基因編碼它使我們能夠在一個簡單的和可比的方式標注幾個nucleoporins。 為了達到最大的標記密度，我們通過RNA干擾耗盡內源性未標記的蛋白質。（奧林巴斯顯微鏡）

你看到了使用新的GSD 3D技術在你的研究領域是什么可能性？

像所有的大蛋白質復合物，人大是一個三維結構，并為了了解它是如何建成，超分子組裝體的所有部分的一個高分辨率三維視圖將是必要的。 盡管我們最近的研究提供了新的見解全國人大支架的組織，我們只能夠確定nucleoporins的位置在一個方向 - 沿孔的半徑。 在3D執行這樣的測量將更加翔實。

此外，我們相信，超高分辨率顯微鏡將成為不只是核孔結構的研究，還包括其他大蛋白組件的有價值的工具。然而，在人大的情況下，我們是由以下事實，即細胞核幾百孔的底部是在相同的方向可見幫助 - 這簡化我們的分析。 這種擇優取向沒有找到許多其他有趣的多蛋白組件的，和超分辨率這種復合物的結構研究將只可能與3D成像。