徠卡顯微鏡STED顯微鏡活細胞的光明染料

細胞生物學的目的是研究優選在活細胞試驗在細胞水平上*小的細節。 通過提供快速和直接*分辨率，STED（受激發射損耗）顯微鏡是用于研究細胞的細節在納米范圍內體內的**工具。 對于活細胞的*分辨率的*佳染料必須是明亮，光穩定，沒有顯示光毒性，理想地發射的遠紅外光譜，并可以在活細胞中被應用。 *近一類新的硅-羅丹明（SIR）衍生物已報道滿足所有這些標準。探頭專門染色細胞骨架和標簽SNAP標簽的融合蛋白是目前市場上買到，取得優異成績受激發射損耗。

硅 - 若丹明的光譜特性

硅 - 羅丹明（SIR）是結構上相關的公知的家庭若丹明熒光團（例如德克薩斯紅和TMR：四甲），但顯示出各種明顯不同的和有利的特性為在活細胞顯微術實驗的應用（參見圖1為結構）。 SIR是一個明亮和遠紅色熒光團具有約650和670納米，其中很少的自發熒光和光毒性發生光譜范圍的激發和發射波長。 長波長允許高穿透深度，從而更深層次的成像。

圖1問：主席先生，基于探針活細胞成像。 （a）在該熒光兩性離子（開放）的形式和非熒光螺（閉合）形式之間的平衡存在SIR衍生物。 探針的配體的靶結合有利于熒光開放的形式，而游離，未結合的探針SIR主要存在于封閉的非熒光的形式，由可逆疏水聚合想必穩定。 （二）在本次審查中描述SIR衍生物的結構。 只有熒光團的封閉螺形式被示出。

非常重要的是，SIRS已被證明是膜滲透性并因此允許染色活細胞中沒有繁瑣的轉染方案。

爵士衍生的另一個重要特點是其熒光字符。 根據它們的環境，它們可逆地采用非熒光螺內酯形式（OFF狀態），或一個高度熒光兩性離子形式（ON狀態），分別為（圖1）。 導通狀態被結合到反應伙伴青睞。 因此，通過適當的設計SIR-熒光團基于探針，熒光在靶結合一個*過100倍的增加得以實現。 其結果是一個高度敏感的成像具有低背景水平，即使沒有通過洗滌步驟除去多余的探針。

在細胞特異性染色

利用SIR的染料活細胞成像需要的目的蛋白的特定標簽。 在一般情況下，這是通過SIR的耦合到靶向配體來實現的。 例如，SIR衍生物特異性與自標記蛋白質標簽，如SNAP-，夾子或暈蛋白標記反應已經描述。*流行的自標記蛋白質標記是SNAP-標簽和相應的SIR衍生物（SIR-SNAP，圖1）是市售的。 SNAP-標記是20 kD的特異性，并迅速用芐基反應的小蛋白（BG）衍生物攜帶熒光團諸如SIR。這允許在活細胞中，甚至在體內的SNAP標簽融合蛋白的特異性標記。 SNAP標簽融合蛋白與SIR的標記在很大程度上受染料的熒光性質容易，一旦轉移到SNAP標簽即其在熒光強度增加。 一個例子突出SIR-SNAP的電位的SNAP-標簽表達在大鼠腦切片的皮層神經元的特異性和高效的標簽。

使用自標記蛋白質標記，如SNAP-標簽僅限于細胞和生物體是服從轉染或遺傳操作。 細胞骨架是一個結構的量直接熒光探針是相當有用的，因為它涉及了大量的生物過程。 要生成合適的探針對細胞骨架的活細胞成像，爵士是結合到微管和F-肌動蛋白配體多西他賽和desbromo去甲物jasplakinolide，分別為。由此產生的SIR微管蛋白和爵士肌動蛋白探針（圖1），現已通過公司Spirochrome，具有很強的熒光，而且非常適合用于活細胞成像（見圖2），因為它們顯示非常低的毒性。 當施加到HeLa細胞，SIR-探針不與形成有絲分裂細胞骨架中的探針濃度足夠高的用于成像干擾：正常中期，后期主軸形態以及卵裂溝的正常外觀觀察在100nm SIR存在肌動蛋白或SIR-微管蛋白，分別。 無論是分裂的持續時間也不增殖率受到影響，在這些濃度。 SIR肌動蛋白與SiR微管蛋白從而允許正常的分裂細胞的細胞骨架的成像而沒有任何明顯的毒性作用。 此外，它們的紅移激發波長*小化光毒性效果經常看到的探針在較短波長。

圖2：SIR-肌動蛋白和微管蛋白爵士在HeLa細胞活成像。 共聚焦和STED圖像對比。 圖片：徠卡。

*高分辨率成像爵士衍生物

所有*分辨率方法依賴于染料的熒光和暗態之間的切換。 因此，可達到的分辨率依賴于染料的光譜性質。 明亮的熒光，耐光性和低光毒性呈現爵士衍生物特別適合于*分辨率顯微鏡。 證明型的原理的實驗表明，SIR衍生物可用于GSDIM / dStorm（基態耗盡接著個別分子返回/直接隨機情形光學重構顯微術）和SIM（結構照明顯微鏡）。 但特別STED顯微鏡和爵士為基礎的探頭相結合是一個非常**的辦法進行*分辨率的活細胞顯微鏡。例如，利用STED顯微鏡和SNAP標簽的融合蛋白的SIR-標簽被利用，以確定以*的分辨率活細胞中心體蛋白的定位。 然而，*令人印象深刻的成績一直在使用活細胞STED顯微鏡和SIR-actin和爵士微管蛋白來實現的。（奧林巴斯顯微鏡）

SIR-肌動蛋白標記和STED顯微鏡證實了環狀肌動蛋白結構在活初級大鼠海馬神經元軸突的輪圈（圖3a，b）中。 肌動蛋白中的軸突這種規則空間排列已經首先通過*分辨率顯微鏡用X莊的組觀察到對固定的樣品.重要的是，肌動蛋白在軸突相同的周期性，現在觀察還現場樣品。 生物結構在活細胞中的特性是非常重要的，因為它避免了固定工件。

類似的觀察結果與爵士 - 微管蛋白制成。 該中心體的外周的微管和微管可在SIR微管蛋白來揭示染色由STED顯微鏡活的人成纖維細胞與在活細胞中實現了**用于成像微管的*高分辨率：所測得的微管的直徑在這項研究中約為40納米（圖3c）。 這也表明，探針直接靶向微管或其他感興趣的結構可以顯著提高分辨率：微管標記有SIR-SNAP和微管結合蛋白的活細胞STED顯微鏡產生微管的直徑約80納米，即2倍下比與SIR-微管蛋白得到解決。 此外，STED顯微鏡與SiR微管蛋白的結合允許首次在活細胞中的中心粒的體系結構的直接可視化。 中心體的關鍵部件是中心粒，九個三胞胎微管構成的圓筒狀的結構。 在成像沾上爵士微管蛋白的人成纖維細胞中心體透露環沿其外圍（圖3D）呈現明顯的調節亮度。 相鄰*大值之間所測量的極角等于大約40°，這是與中心粒的已知9倍對稱性完全一致。 這些和其他的活細胞STED顯微鏡實驗用紅外探頭基礎的展示方法的巨大潛力。

A）                                                                      B） 

C）                                                      D）

圖3：活細胞STED顯微鏡。 A）STED圖像顯示沾滿爵士肌動蛋白的大鼠原代海馬神經元軸突。 比例尺，1微米。 B）的SIR肌動蛋白條帶的強度測量的信號輪廓配合到多個高斯分布和估計相鄰峰之間的間隔。 的約180納米的結構的測量周期是固定的樣品中所測量的周期性的實驗誤差范圍內。 C）微管沾上爵士微管蛋白在人類原發性皮膚成纖維細胞圖像。 沿著白虛線測量的微管的直徑為約40納米。 d）在理查德森 - 露西去卷積后中心體染色微管的代表STED圖像; 所觀察到的環是沿其縱向軸線的中心粒的投影。 測得的極角在兩者之間相鄰的熒光強度的*大值沿中心粒的周邊測得為大約40°。 的中心粒的直徑，結果為176左右納米。

*佳的染料

總之，硅 - 若丹明衍生物非常接近*優探針活細胞*分辨率顯微鏡，因為它們

明亮，光穩定;

很高興在遠紅;

有熒光;

顯示毒性小; 和

是細胞滲透和生物相容性。

STED顯微鏡與爵士染料在非常高的分辨率，適中的漂白提供了明亮的圖像。 一句話：SIR-基于熒光探針和STED顯微鏡是**匹配低于衍射極限的活細胞成像。