徠卡顯微鏡冷凍電鏡在纖毛和鞭毛新的見解

纖毛和鞭毛是*細胞器被發現并且已經研究了幾個世紀。 但是，在人類中的重要作用，以及如何睫狀缺陷引起的疾病仍然沒有得到很好的理解。 冷凍電鏡*近流下了新光源對他們的內部運作，并解決了一些長期存在的謎團，只有提高對纖毛和鞭毛的功能是如何的新問題。

介紹冷凍電鏡

低溫電子顯微鏡（冷凍電鏡）允許用于觀察生物樣品盡可能接近天然狀態盡可能的高分辨率結構。與傳統的電磁法沒有化學固定劑，如戊二醛或osmiumtetroxide，或對比增強重金屬的污漬，如乙酸雙氧鈾，被使用。這*大限度地減少了固定和染色文物的風險。相反，將樣品快速冷凍并直接在電子顯微鏡可視化而被不斷地冷卻，在溫度低于-160℃。 用于小樣本-蛋白質復合物，脂質體（參見圖1），病毒，原核細胞，細胞器-浸沒冷凍（“切入凍結”）是選擇的樣品制備方法。使用格柱塞諸如徠卡EM GP，薄膜樣本是通常為20至500納米厚是制備并快速冷凍在冷卻冷凍劑如乙烷在溫度剛好高于冷凍劑的熔點，以便實現樣品的玻璃化。 較大的樣品（*常見的是，真核細胞和組織）太厚為切入冷凍，并且可以使用高壓冷凍隨后冷凍切片制備。

圖1：冷凍電鏡顯微照片，顯示所引起的膜蛋白（NEC220）的突變中的脂質體（的LUV）的形態變化。 比例尺：500納米（A）; 100納米（B＆C）。 從Bigalke等人，2014年修改。

新的見解和纖毛鞭毛由冷凍電鏡

已特別是從冷凍電鏡的分辨率增加受益的一個研究領域的一個例子是纖毛和鞭毛的研究。 纖毛和鞭毛是高度保守的，普遍的運動和在真核生物執行許多重要任務傳感細胞器。在人類睫狀缺陷引起多種病癥和疾病，統稱為ciliopathies。鏈接結構的功能是必不可少的理解纖毛是如何工作的，以及為什么它們在疾病失敗。 樣品制備通過冷凍水墊隨后結冰由低溫電子斷層掃描（低溫ET） - 一個三維（3D）冷凍電鏡技術 - 隨后的圖像處理（subtomogram平均）已被證明是非常成功的策略，以獲得*的見解3D結構和纖毛和鞭毛的功能（圖2和3）。 冷凍ET引入只在2006年纖毛研究不僅提供了更高的分辨率，接近原生狀態，3D結構，也極大地改變了我們如何纖毛的功能，什么不順心的疾病的認識。相比于僅僅在幾年前，我們現在知道，微管是不是空心的，空管，但含有微管內的蛋白質（MIPS）; 在連接蛋白的鏈接被發現數十年前，現已被確定為動力蛋白的一部分管制絡合物; 徑向輻條具有小的結構和可能的功能差異，我們有我們的*一瞥數萬動力蛋白馬達分子如何協調以生成纖毛運動。隨著這些突破了許多新的問題已經被提出，并仍在等待答復。（奧林巴斯顯微鏡）

圖2：冷凍-ET衍生斷層片和平均96毫微米重復等值面效果 - 真核纖毛和鞭毛的構建塊。 比例尺：100納米。 從Heuser先生等人，2012。

圖3：低溫-ET從衣藻 （綠藻）和海膽 （海膽）平均后得到的鞭毛平均中央機構的結構等值面效果圖。 從卡瓦哈爾岡薩雷斯等人，2013修改。

挑戰與改進/相關顯微鏡

冷凍電鏡的增加的分辨率和質量是有代價的：已知的問題，包括輻射敏感性（由于不存在化學固定劑）和低對比度，噪聲圖像（低信噪比由于缺乏重金屬對比的試劑）。 這些挑戰通常可以通過操作該顯微鏡在低劑量模式，以盡量減少樣品暴露于輻射和使用圖像處理（平均化），以從多個圖像中的信息相結合，以增加信噪比，并*終分辨率來克服。 相制版技術，尤其是直接電子探測器的*新進展已推向接近原子范圍內實現分辨率

然而，雖然冷凍電鏡提供感興趣區域的高分辨率快照它既不適合掃描的更大的區域，也沒有對實時成像。這些不足可以通過如相關光學和電子顯微鏡（CLEM）相關顯微鏡技術來克服。 CLEM結合了兩全其美。 光/熒光顯微鏡用于易活細胞成像，觀察標記（如綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白），以確定合適的時間和感興趣的領域。然后這個區域進一步用電子顯微鏡的分辨率高功率（圖4）檢測。 一個令人興奮的新的有前途的CLEM發展是徠卡冷凍階段，其允許觀察冷凍樣本由光/熒光顯微鏡在溫度低于-160℃。 這不僅大大地減少熒光漂白，但也允許感興趣的冷凍樣品中的區域（通常熒光標記的目標）的光/熒光顯微鏡鑒定*。 然后將樣品（同時仍然被冷卻在低于-160℃）可以很容易地轉移到電子顯微鏡，以通過冷凍電鏡重溫的高分辨率研究感興趣的區域。

圖4：高壓CLEM冷凍并冷凍取代的HeLa細胞（使用徠卡EM HPM100和Leica EM AFS2）：感興趣的細胞是由熒光標記物識別和DIC（A，B，D）的熒光顯微鏡（C）的可視化和EM在低（C），介質（F）和高分辨率（G，H）。 從修改的

**為止，每一個分辨率增加EM去手牽手與有關的結構和功能的重要的新的生物發現。 并沒有跡象表明，這一趨勢將很快結束。