我們都知道，熒光顯微照片揭示了在組織中的分子標記的位置，對不對？好吧，也許不是。 事實上，你可以很確定，在熒光模式大多數激光掃描共聚焦顯微鏡測量的是在某一特定時間所收集的光子數的某些功能。 我們希望這是一個或兩個有趣的參數的精確測量 - 局部分析物的濃度或局部離子濃度。 事實上，許多因素會影響實際存儲在計算機存儲器中在任何給定時刻的數值。

一個通用的激光掃描共聚焦顯微鏡示出了一些在本文中提及的“39”特征的位置的流程圖示于圖1。 示的系統是基于配置為活細胞成像的倒置光學顯微鏡。 在下面的文本稱為單個組件被標記為與至（g）的字母（a）所示。 該圖示包括三個光學部分，在不同的高度，通過抗體標記的果蠅胚胎采取沿z軸，并指定Z1，Z2和Z3。

多年來，學生參加活細胞的三維顯微各月期間舉行，英屬哥倫比亞大學，編譯這些外在因素的清單。 在*年中，列表增加至39項，所以我們借用了希區柯克電影的名字為我們的名單。此后，名單繼續成長！ （在球場上的更多信息可以在網絡上在被發現的3-D顯微鏡課程公告板 ）。

雖然這篇文章不能完全描述每個學期，短暫的和有用的解釋也包括在內。 該條款出現在粗體字和粗體字等許多方面交互。 請注意，許多這些變量通常是在其對空間分辨率的影響來考慮的。 他們在這里列出來，因為降低的分辨率轉換成“把精彩的光子數相同到一個更大點”。 這降低了激發強度 - 通過給定的分子中產生的光子的數目 - 和這些檢測到的級分。 人們常常忘記，在熒光共聚焦顯微鏡正常信號電平對應于只有10-20光子/像素的亮區域。 在這種情況下，統計噪聲是空間分辨率比由阿貝式定義的更重要的局限：

dmin = λ0 / (NAobj + NAcond)

在公式中，D（分）表示在一個周期光柵，可以只是被解析的*小間距，并且被表示為在試樣空間橫向距離，λ（0）為光的波長在真空;和NA(obj)和NA(cond)是的物鏡和聚光透鏡的數值孔徑，分別。 該方程確定了物鏡和聚光鏡的數值孔徑在確定圖像分辨率為光的給定波長的作用。

激光單元 （圖1（a））是照明光源，并且在一般情況下，測得的熒光是成正比的激光功率電平。 雖然總的激光輸出功率通常調節，功率是在多行激光的每一行的值可能無法，也可以廣泛地隨時間變化。 波長影響光學性能，而且通過該染料的吸收光譜，它決定了熒光的產生量。

功率輸出不穩定通常是噪音，它的不穩定性通常小于1％，但隨著年齡的激光可以變得越來越不穩定。 因為灰塵，未對準，或機械不穩定性可導致10-30％的隨機變化， 光學耦合到所述連接光纖（如果使用的話）是至關重要的效率 。

激光反射鏡對準和反射特性可以是長期漂移在源代碼中的激光輸出。 由于激光的光源是由激 光反射鏡來確定， 波束指向誤差和/對齊是很重要的。 不穩定這里將顯示為亮度變化，因為變化的視在源的位置將改變耦合激光光線進入單模光纖中大多數儀器中使用的光學器件的效率。

物鏡 （圖1（b））的數值孔徑的影響通過可收集樣品發出的光的分數。 這也適用于光從激光。

物鏡放大倍率是負相關的物鏡入射光瞳的直徑。 該目標將只有正常工作，如果整個入瞳充滿了令人興奮的激光。 填充不足會降低空間分辨率和強度的峰值。 載入過多會引起一些激光罷工客觀的金屬安裝和丟失，也減少了光斑的強度。

清潔度是很重要的，并且臟光學產生更大和調光斑點。 傳輸 （光入射，可以聚焦到一個點上它的另一側的物鏡的分數）隨波長而變化。 提防使用一些較新的，多層光學在紅外范圍內的。 色差和球面像差都使光斑變大，并且隨波長。 此外，球面像差與蓋玻片的厚度和浸漬并包埋介質的折射率變化很大。

衍射是不可避免的限制的光學分辨率。 它有效地放大物體比衍射極限較小的圖像，使它們顯得暗淡比他們應該的。

掃描系統 （圖1（c）），尤其是縮放倍率的控制，決定了一個象素中的試樣的尺寸。 對于Nyquist采樣，像素應該比你希望看到在你的樣品的*小功能小至少兩次。 假設200納米的瑞利準則的分辨率，像素應該是小于100納米。 較大的生產欠，減少小功能所記錄的亮度。

漂白率的影響正比于變焦倍率的平方。 為掃描速度 ，較長的停留時間在一個特定的像素，所述多個信號將被檢測到，并在減它將由泊松噪聲失真。 在高掃描速度下（小于100毫微秒/像素），從染料的熒光衰減常數的長度*過這一停留時間信號可以被減少。

光柵尺寸 -連同變焦倍率，沿著柵格的邊緣像素的數目將確定的像素尺寸。 更多的像素（1024×1024與512×512），使欠采樣的可能性較小，但意味著一個人必須要么花費更少的時間在每個像素通過減少收集光子的數量，增加泊松噪聲，或需要更多的時間來掃描大圖和可能導致更多的漂白。 光學或掃描鏡可以引入幾何失真 ，可能導致物體的形狀和所述圖像之間的不一致。 環境是很重要的：振動和雜散電磁場可以通過多種設備引起的，例如，冷卻風扇。這可能會導致產生扭曲，可能會隨時間變化不正當鏡偏轉。

其他光學元件包括傳輸 ，它描述不存在于光學元件，特別是中性密度或帶通濾波器，分束器和目標的吸收和反射損失的量度。 思考從空氣/玻璃界面通常表示丟失的信號，但可能會出現亮點無關樣本結構。 鏡面反射率可以是波長的強功能的紅外線和紫外線，并降低暴露在潮濕和灰塵。

蓋玻片的厚度是*昂貴的光學組件和*有可能被不小心選擇。 它應該是170±5微米的厚度。作為浸油 ，其折射率必須完全匹配所用的物鏡。 這可能只發生在一個小的溫度范圍內，以及可選地，它可以是自定義的混合。 聚焦平面上的位置是重要的，因為略高于或焦點的平面之下的特征會出現比在焦點平面的特征的調光器。 當收集的三維數據，奈奎斯特采樣，還必須實行的z軸的平面的間隔。 *后， 該階段的機械漂移可導致實際成像隨時間變化的對象的平面。

感興趣的染料的濃度可能是你正在試圖測量。 滲透入試樣往往是離子強度和pH值的函數（或從空間排阻）是什么。 的吸收截面是令人興奮的光子通量，這將通過染料分子被吸收的分數的測量。 它是由共軛探頭，pH值，特定離子的濃度和離子強度的方法的影響。

量子效率描述了機會，能量從一個激動人心的光子吸收將被重新輻射的熒光光子。 它是波長的強函數，并且還受pH值，特定的離子濃度，離子強度和染料-蛋白質相互作用。當激光功率大于1毫瓦使用具有高數值孔徑的物鏡時單線態飽和 。 然后，光的強度足以將大部分接近交叉的染料分子進入激發狀態，從而減少了有效的染料的量子效率。

裝載是指染料的你把你的細胞數量。 重要的變量包括染料分子/抗體的數量，或者其它蛋白質標記，并用于固定/透化協議。 猝滅是由附近的其他人從1染料分子發出的熒光的吸收。 卸載是指染料，這是在細胞內，但是現已泵出或以其它方式失活。

底物反應的稅率適用于染料與那些與他們的互動與細胞離子或其他分子的熒光性質。 像素的駐留是微秒數量級上，因此有可能沒有足夠的時間以達到平衡。 預漂白是指染料的脫色本測定之前進行即可。

條塊是染料的細胞內過程的重新分配。 染料/染料的相互作用不僅指剛才提到的淬火，而且還對熒光共振能量轉移（FRET）。 發生這種情況時，一種染料的發射光譜與第二染料分子的吸收光譜重疊，幾納米的路程。FRET可導致光的僅在第二染料的發射波長的發射。 如果第二分子不是熒光的，如通常發生的，熒光丟失或淬滅。 染料對試樣的影響，可能會影響許多環境變量，包括樣品的生存力的降低。

試樣 （圖1（d））和它的嵌入介質的折射率，將決定的球面像差存在的嚴重程度。 即使是觀看使用水目標水生物標本，對手是不可能做到**，甚至接近。 這種類型的球面像差是隨著穿透深度的信號損失的主要原因。

它必須使用的浸油具有正確的折射率和色散（與波長的折射率的變化）。 同時，要確保沒有氣泡，將作為在沉浸介質中間的鏡頭。 檢查通過集中上下同用于調整你相環的勃氏鏡。

試樣的重要狀態可以影響的實驗的結果，因為，例如，將死的細胞具有不同的形狀，大小和離子的環境中不是活的。 自發熒光是指內源性熒光化合物的存在。 這些分子的效率可與pH值，離子濃度和代謝狀態而有所不同。 額外的自發熒光可以通過固定不當使用戊二醛特別是當生產。

目標和重點的平面之間折光結構或細胞器，例如，脂質球形球，可能會重新聚焦光束到一個完全未知的位置。 更小的特征可以具有較小的影響，但該光散射出來的光束的任何折射的功能將降低檢測信號的激發點，因而強度。 它們的累積效應也加起來具有折射率比水高得多的細胞。

存在或不存在高度染色的結構的上方或下方的聚焦平面指的是z軸分辨率是有限的。 大型結構還可以吸收大量的令人興奮的光，如果高度染色。

穿過針孔 （圖1（e）），該信號正比于針孔的直徑的平方（或它的大小 ），它通常被設置為等于艾里斑處的平面內的直徑針孔。 對齊是很重要的，并且被聚焦到試樣，然后通過光學系統重新聚焦回到激光器的圖像應該與針孔的中心重合。

檢測器 （圖1（F））通常為光電倍增管（PMT）。 檢測到的信號是成正比的量子效率 。在大多數共聚焦儀器中使用的光電倍增管的有效量子效率從約15％下降到在藍端在光譜的紅色端約4％。 至于響應時間 ：大多數的熒光信號，能夠迅速被放大，但探測器他人，如跨膜電流，響應速度很慢，使得慢掃描速度必要的。

光電倍增管的電壓決定了光電倍增管的放大。 50伏的增加對應于約2更在增益因子。 要注意的是光電倍增管的黑電平或（亮度）控制允許任意數量的加法或減法從提出到數字化的信號。 黑電平應該被設置成使得在圖像的*暗部分的信號電平是5-10的數字單元。

有噪聲的許多可能的來源，都將扭曲的入賬價值。 通常情況下，光電倍增管產生的暗電流噪聲相比，信號電平是很小的。 然而，這是被允許變熱或查看很差染色標本時紅敏光電倍增管不假。 除了從任何雜散光，可能無意中到達光電倍增管，主要剩余噪聲源是泊松或統計噪聲。 這等于記錄在一個給定像素的光子數的平方根。 其結果是它變得更大以較高信號電平，即使信號與噪聲的比率提高。

數字化 ，通常使用的計算機（圖1（克））應該是線性的。 提交的“8位”顯微鏡的數字化裝置的電子信號必須是大小介于1和255之間要被記錄的。 由于統計噪聲，介于10和220的值是更安全的。 數字轉換系數是指檢測并存儲該數的光子數之間的比率。 這依賴于光電倍增管的電壓和其它電子增益，但通常為約30，用于記錄在8位儀器正常標本。

記住，要衡量這些因素精確，必須持有其他38不變。 祝你好運！