徠卡顯微鏡：熒光顯微鏡發光的基本原理
有很多自然界中的發光過程。發光是一個總稱，這些類型的發光的事件是沒有結果的高溫。這篇文章描述了不同形式的發光和熒光的情況下進入細節。相關的技術術語描述熒光，就像淬滅，漂白或量子產率，說明在第二部分的文章給予詳細的洞察熒光分子的基本特征
發光過程
一些共同的生物學或生物化學實驗室方法是基于幾個“... escences”，如磷光，化學發光，生物發光和最后熒光的存在。熒光蛋白作為一個引進的話題，它可能是非常有用的學習多一點“... escences”。這些現象的起源在于拉丁詞見：escentia，這已經意味著我們的視覺系統的連接。所有“... escences”描述，我們可以用我們的眼睛感知的物理，化學或生物過程。我們添加后綴“...... escence”詞匯的變化，行動或過程像字療養。
所以，很顯然，熒光的東西，我們可以看到，一些涉及變化或過程。我們將學習如何熒光滿足這些條件后。首先，我們將采取短期看看其他“... escences”，這是所有luminescences本身發光發光，這不是一個高溫的影響是通用的術語。因此，發光可以決定作為一個外表冰冷的身體輻射。這種輻射可以是化學反應或亞原子運動或在晶體上的應力的一個原因。作為結果的熱量的物質（例如，熱金屬）所發出的光，以產生發射的另一種方法是白熱。
化學發光的發光過程中的化學反應的基礎上，該產品具有的激發中間體。這中間落入地面狀態時，發光。不同于熒光，化學發光材料中的電子被激發，通過化學反應，而不是由光子的吸收。化學發光認定其技術應用在例如熒光棒。一個眾所周知的化學發光物質是魯米諾，它是用來在刑事找到血液的痕跡。在這里為Fe 2 +離子，它是存在于血紅蛋白作為催化劑的功能，使魯米諾發光配置。
如果一個生物體發光的，我們講的生物發光，不管如何產生光。有很多生物體產生光，就像螢火蟲（夜光Lampyris）或螢火蟲（北美產螢火蟲）。其他幾種真菌在一排是一個非常特殊的有機體的的杰克O'Lantern蘑菇（Omphalotus nidiformis），在黑暗中發光。大量的海洋生物，如一些珊瑚，藻類，crustacaea，甚至魷魚發光，大多是在藍色或綠色的頻譜。海居民Aequorea victoria的水母bioluminating 源的綠色熒光蛋白（GFP）。而螢火蟲，例如只使用一個化學過程，產生光，A. 維多利亞使用化學發光和熒光過程。科學家發現，水母蛋白水母發光蛋白的幫助下，通過化學反應產生藍色光。然后，使用該藍色光激發綠色發光熒光反應導致已經提到的綠色熒光蛋白在。
這使我們的問題是：“什么是熒光？” 熒光物質發光波長較短的光的吸收的效果是一個過程。波長的差異被稱為斯托克的移位。詳細地說，如果發生熒光的物質吸收光的光子的形式。這導致了電子的偏移到更高的能級。但這種高能量的情況很不穩定，這就是為什么電子傾向于返回到基態。在此過程中的能量，可以被看作是一個發光的光子的形式再次釋放。磷光相比，電子能量轉移是非常快的，事實上，在納米秒的范圍內（第1圖）。能擁有一種不同的發光波長與另一種不同的波長激發后的任何物質，這是被稱為熒光染料。在下一節中討論了這些問題。最受歡迎的發熒光的物質，存在于自然界中有廣泛的激發和發射光譜，但具有明確定義的最大激發和發射的物質是更加有用的熒光顯微鏡。 類似的熒光，磷光與光激發磷光材料的發光的現象。即使它是密切相關的熒光，它是慢得多。熒光相反減速的再次發射的光子激發的電子能量由協會與“禁止”狀態。不會發生熒光的情況下盡可能快，因為他們返回到基態能量被“困”。磷光材料的典型例子是“輝光在這黑暗的”可以“充電”與普通燈泡或日光，然后發光幾分鐘甚至幾小時的玩具。 圖 1：熒光雅布隆斯基圖的 如上面已經提到，熒光染料是任何能夠發出熒光的物質。在我們的例子中，熒光蛋白是一種熒光染料。在進入細節之前，我們將介紹一些詞匯及用語描述一種熒光蛋白。一個字的使用非常頻繁，在與熒光熒光：熒光分子（如蛋白質）的那部分，這是負責其能力熒光。因此，GFP或其衍生物GFP或其衍生物與任何雜合蛋白的熒光基團（例如，α-微管蛋白-GFP）。但是，不具有熒光團是一種蛋白質。FITC，TRITC（20個原子）量子點（100-100,000原子）等小分子，如熒光基團。 尋找稍微深一點到熒光團中，我們到達的發色團，它是一種分子，它的顏色定義（第2圖）的部分。內的發色基團，電子和互連的發光（見上文）的能量電平轉換發生。有至少兩種形式的發色基團。或者為它們的共軛π電子共振系統（GFP），或金屬配合物（葉綠素，血紅素）構建。 由于其相關的顯微鏡，我們將采取仔細看看GFP生色。事實證明GFP的發色團的形成沒有其他的輔助因子或酶組分比分子氧是必要的。定義的綠色熒光蛋白的氨基酸主鏈的一級結構，自發形成中的自催化的折疊機構，并通過分子內重排完成。進入的細節，發色基團是由三個相關的氨基酸Ser65，Tyr66，Gly67依次進行的環化，脫水和氧化。這些反應的結果是一個共軛的π-電子的諧振系統，成熟的綠色熒光蛋白發色團。 尋找上面的整個GFP結構，環狀三肽坐落在中間的氣缸。該筒體是由11股線形成的β-桶結構，使蛋白質高的穩定性。β桶結構具有的直徑為3nm左右，高度為約4nm（第3圖）。到目前為止已知的所有的FPS有這樣的保護筒光物理性質上有很大的影響。在綠色熒光蛋白基因的情況下，量子產率和光穩定性也比較高。此外，非常緊湊的蛋白質結構導致的高pH電阻。用GFP標記的樣品是相對穩健的溫度和高耐受性物質，如多聚甲醛，尿素或鹽酸胍變性。 圖 2：層次熒光蛋白 圖3：綠色熒光蛋白（GFP）的分子結構 盡管如此，還是有一定的局限和限制應在下一節中提到的FPS。淬滅的過程中，例如，熒光團的強度，以可逆的方式降低。這種衰變的原因有多種。一方面，有可能是一個復合物的形成或一個內部轉換。另一方面淬滅可以是能量傳遞過程的效果。稱為FRET顯微應用需要利用這個程序。在福斯特共振能量轉移或熒光共振能量轉移到受體熒光A.熒光的D降低，而A增加的熒光，能量轉移的供體熒光e。 淬滅是一個可逆的過程相反，是一種不可逆的熒光下降過程被稱為漂白。永久熒光損失是基于長時間暴露在激發光的熒光破壞。漂白的量依賴于光源的強度，照射時間和能量。每個熒光漂白劑之前有一定的激發和發射周期。在GFP的情況下，每個分子可興奮約10 4 -10 5倍。符合0.1-1小號。 使用共聚焦激光掃描顯微鏡的光強度約為10 6 W /米2是常見的。這種高能劑量提供光子過量導致的現象，很多熒光分子的激發狀態。在這種情況下，他們不再在其通常的波長吸收光。有了它，有效的染料濃度的減少，或者換句話說，在顯示器上示出的像素是不再染料濃度的直接函數。與此相反，以用一個簡單的弧燈的照明，可以使用高能量的激光的激發和發射之間的一種非線性的關系。 談到熒光蛋白的效率，我們應該提到的量子產率。這是另一種熒光團的特征相比，光子的輸入和輸出。對于某些熒光量子產率計算，除以發射光子吸收的 亮度的熒光蛋白是應用熒光顯微鏡時要考慮的另一個重要特點。根據顯微鏡的質量參數是在一個實驗的成功的一個關鍵點。一種客觀的方式來指定一種熒光蛋白的亮度是其摩爾消光系數的乘法運算，其量子產率除以1,000。摩爾消光系數的一種物質，告訴我們一些關于其在不同的波長的光的吸收。詳細地說，摩爾消光系數是一個維度中的物質的摩爾濃度為1厘米以上的距離在不同的波長的電磁輻射的吸光度。因此，對應的單位是M -1 cm -1的。 在此計算中的幫助下，它可以用來比較的亮度不同的熒光蛋白。如果我們把摩爾消光系數為5.6萬平方米-1厘米-1和量子產率0.6EGFP的例子中，我們得到了一個價值33.6 M -1厘米-1。有時人們談論的相對亮度的熒光蛋白。在這種情況下的亮度乘以摩爾消光系數與量子產率和綠色熒光蛋白（33.6 M -1厘米-1）的亮度值除以計算。通過這樣做，相對亮度轉換為眾所周知的EGFP的速度稍快，使不同的熒光蛋白的比較 處理大量的熒光顯微鏡實驗觀察活細胞。以淬滅等特點，并考慮到漂白，生命細胞成像很明顯，是高度依賴于時間。即使在組織學的或固定的細胞樣品的情況下，重要的是不要太長的時間和太多的光強度，照射試樣。描述感興趣的抗蝕劑降低其熒光行為的機制的熒光蛋白的能力的參數的耐光性，耐光性被表示為通，直到為初始亮度的50％消失了的秒數。為了進行比較，和最多為10瓦/厘米2的弧光燈提供照明，而高強度的光源，如激光（高達100瓦/厘米2），可能會產生的非線性效應。此外，測量和比較的耐光性，熒光蛋白樣品的pH值是標準化，以適于一個典型的哺乳動物細胞的大小的7.0和蛋白質溶液的液滴。相鄰的具有上述的光源照明，是連續的。平行輻射產生的光子進行計數。EGFP的情況下，需要174秒的原始亮度的一半褪色（沙納等，2005）。換言之，排放量減少至1,000至500光子/秒174秒。 了解不同的特點，如激發和發射極大值，亮度，量子產率等有一定的熒光染料或蛋白實驗者能夠選擇不同的候選人或觀測條件滿足他的要求，具有一定的實驗設置。此外，他是能夠詳細地解釋結果，如果他知道照片的物理特性不同的熒光染料或蛋白質。
熒光染料
淬滅和漂白
量子產率
亮度
耐光