初級概念

特定分子種類之間的相互作用的活細胞中的精確位置和性質是在生物學研究的許多領域主要關心的，但是調查經常被用來研究這些現象的文書的分辨率有限的阻礙。 常規寬視場熒光顯微鏡使在由瑞利判據，約200納米（0.2微米）所定義的光空間分辨率極限本地化熒光標記的分子。 然而，為了理解所涉及的典型的生物分子的過程蛋白伙伴之間的物理相互作用，分子的相對接近度，必須更精確地確定比衍射限制的傳統的光學成像方法許可證。 熒光共振能量轉移的技術中，當施加到光學顯微鏡（更常用的縮寫為FRET簡稱），允許確定幾個納米內的兩個分子之間的做法（見圖1），一個距離充分接近用于分子間的相互作用，以發生。

典型的熒光顯微鏡技術依賴于吸收由光的熒光團在一個波長（激發），其次是次級熒光的波長更長的后續發射。 激發和發射波長通常彼此分離，以幾十到幾百納米。 細胞組分，如細胞核，線粒體，細胞骨架，高爾基體，和膜，以特定熒光團的標記使固定和活制劑內的定位。 通過同時標記幾個亞細胞結構與具有分開的激發和發射光譜個別熒光團，專門熒光濾波器的組合可以被用來檢查標記的分子在一個單一的細胞或組織切片的接近。 利用這種技術，分子更靠近在一起比光學分辨率極限看來是一致的，這明顯的空間接近性，表明一個分子締合是可能的。 在大多數情況下，但是，正常衍射限制熒光顯微鏡的分辨率是不夠的，以確定生物分子之間的相互作用是否實際發生。 熒光共振能量轉移是由從激發態的熒光團的能量的非輻射轉移發生在靠近的第二發色團的方法。 因為在其上的能量傳遞可以發生限制在大約10納米（100埃），而轉移的效率的范圍是熒光團之間的間隔距離極為敏感，共振能量轉移測量可用于探測分子相互作用的有價值的工具。

熒光共振能量轉移的機制涉及的供體熒光團在一個激發電子態，其可以在一個非輻射方式通過遠程偶極-偶極相互作用的激發能量轉移到附近的受體發色團。 理論支撐能量轉移是基于一種治療激發的熒光團作為振蕩偶極子，可以經受與具有相似的諧振頻率的第二偶極的能量交換的概念。 在這方面，共振能量轉移類似于耦合振子，例如一對音叉振動在同一頻率的的行為。 與此相反，輻射能量轉移，需要發射的光子的和再吸收，并且依賴于物理尺寸和樣品的光學性質，以及該容器的幾何形狀和波前通路。 不像輻射機理，共振能量轉移可產生顯著量有關的供體 - 受體對的結構信息。

共振能量轉移不是熒光團的周圍溶劑殼敏感，因此，會產生特有的，通過溶劑依賴性的事件，如熒光猝滅，激發態反應，溶劑松弛，或各向異性測量表明分子信息。 于參與共振能量轉移熒光基團的主要溶劑的影響是在供體和受體的光譜特性的影響。 發生非輻射能量轉移過更長的距離比短程溶劑效應，以及成分的介電性質（溶劑和宿主大分子）位于所涉及的熒光團之間對共振能量轉移的功效，這主要取決于非常影響不大供體和受體熒光團之間的距離。

熒光共振能量轉移的現象不是由光子發射介導，而且，甚至不要求受體發色團是熒光的。 在大多數應用中，然而，無論是供體和受體是熒光，和能量轉移的發生本身表現通過供體熒光和減少的熒光壽命的淬火，也伴隨著增加受體的熒光發射。 能量轉移過程的效率成比例地分離供體和受體分子的距離的倒數第六功率變化。因此，FRET測量可以用作一個有效的分子尺 ，用于確定生物分子標記與合適的供體和受體熒光染料時，他們中的10納米彼此之間的距離。

連接到相同的大分子蛋白質的相對端的兩個熒光染料之間的熒光共振能量轉移的一個假設的例子示于圖1中的天然構象（圖1（a）），這兩個熒光團是由約12納米的距離隔開，太多的熒光染料之間的分子內能量轉移發生。 但是，當蛋白質被誘導經歷構象變化（圖1（b）），這兩個熒光染料被帶到更接近在一起，現在可以參與的FRET的分子相互作用。 在該圖中，供體熒光的激勵是通過圍繞黃色三核的芳族分子藍色輝光表示，而相應的受體發射（圖1（b））由圍繞在右側的第二雜環熒光綠色輝光表示蛋白質 - 手側。 能量轉移測量常常用來估計對大分子站點和對這些距離的構象變化的影響之間的距離。 在這種類型的實驗，能量轉移的程度被用于計算供體和受體之間的距離，并獲取有關大分子的結構信息。（奧林巴斯顯微鏡）

雖然熒光共振能量轉移經常被用于研究在蛋白質和脂類分子內和分子結構和功能上的修改，在活細胞中的一個主要障礙實施FRET顯微技術一直缺乏合適的方法用于標記特定細胞內蛋白質與合適的熒光團。 水母綠色熒光蛋白（GFP）及其在多種細胞類型中表達的克隆已經成為一個重要的關鍵顯影標記兩者的基因表達和結構蛋白定位在活細胞中。 該蛋白質的幾個光譜不同的突變的變體已經被開發，包括發射藍光（ 藍色熒光蛋白，BFP）的熒光蛋白質。 既激發和用于母體GFP發射光譜和BFP的突變體充分分開在波長為與FRET方法兼容。 圖2示出的策略檢測使用熒光共振能量轉移和突變熒光蛋白質的蛋白質 - 蛋白質相互作用。 如果兩種蛋白質，一種標記用BFP（供體）和其它用GFP（受體），物理交互，然后在受體發射*大值（510納米）時，配合物是激發在*大吸收波長將觀察到強度增加（380納米）的供體。 蛋白質的未形成復合物的結果中沒有受體（GFP）的熒光發射。

加上在脈沖激光器，顯微鏡光學，和基于計算機的成像技術的進步，貼標簽技術的發展，其中，供體和受體熒光團實際上本身已啟用了動態蛋白質相互作用的可視化的活細胞內的生物分子的一部分。 除了蛋白質配偶體相互作用的調查，*近熒光共振能量轉移的應用包括蛋白酶活性的研究中，在膜電壓電位，鈣代謝的改變，以及高通量篩選測定法的傳導，例如用于基因表達的定量單個活細胞。

熒光共振能量轉移原理

共振能量轉移（RET）的過程可以發生在處于電子激發態的供體熒光團轉讓其激發能量向附近的一個發色團，該受體。 原則上，如果供體分子的熒光發射光譜重疊的受體分子的吸收光譜，和兩者的*小空間半徑內，供體可以直接其激發能量通過長范圍偶極 - 偶極分子間轉移至受體耦合。 在20世紀40年代末提出的西奧多·福斯特一個理論*初描述參與共振能量轉移的分子間的相互作用，而福斯特也制定了正式的方程式定義的傳輸速率，發色團距離，所涉及的發色團的光譜特性之間的關系。

共振能量轉移是一個非輻射的量子力學的過程，不需要碰撞，并且不涉及生產熱。 當能量轉移發生時，受體分子猝滅供體分子熒光，并且如果受體本身是熒光染料，增加或敏化熒光發射被觀察（參照圖3）。 這種現象可以通過激勵包含供體和受體分子的光對應于*大吸收供體熒光團的波長的試樣進行觀察，并在波長為中心的附近的發射*大值的受體的檢測發出的光。 另一種檢測方法，在普及迅速增長，是測量受體的存在和不存在供體熒光團的熒光壽命。

示于圖3是雅布隆斯基示出的供體發射和受體吸光度在熒光共振能量轉移之間所涉及的耦合轉換。 吸收和發射的轉換是由直的垂直箭頭（綠色和紅色，分別）表示，而振動弛豫由黃色波浪箭頭指示。 耦合過渡繪制與建議其正確位置在圖雅布隆斯基他們應該已經出現，從光子介導的電子躍遷虛線。 在合適的接受體的存在下，供體熒光團能夠在不發射的光子（圖3中由一個藍色箭頭示出）直接傳遞激發態能量給受體。 所得敏熒光發射具有與所述受體的發射光譜特性。

幾個標準必須被滿足，以便共振能量轉移發生。 除了供體和受體分子的重疊的發射和吸收光譜，兩個所涉及的熒光團必須定位的范圍內互相為1?10納米范圍內。 如由福斯特來自方程描述（和下面討論），供體和受體分子之間的能量轉移效率隨著分離兩個距離的第六功率。 因此，供體熒光團的由非輻射相互作用其激發能轉移到受體的能力與分子之間的距離的增加，限制了FRET現象到大約10納米的*大供體 - 受體分離半徑急劇減小。 在距離小于1納米，能量和/或電子轉移的幾個其它模式是可能的。 共振能量轉移過程的距離的依賴性是為其在分子間的相互作用的調查工具的主要基礎。 在活涉及分子標記與供體和受體熒光團細胞的研究中，共振能量轉移會發生僅分子足夠接近彼此生物相互作用之間。

用于共振能量轉移的附加要求是，供體分子的熒光壽命必須具有足夠的持續時間，以允許所述事件的發生。兩個速率（K（T））和能量傳遞的效率（E（T））直接相關的受體的存在和不存在下的供體熒光團的壽命。根據福斯特的理論，和實驗驗證，能量轉移的速率由下式給出：

其中R（0）是福斯特臨界距離，τ（D）是在不存在受體的供體壽命，r是分離的供體和受體生色團之間的距離。 的福斯特臨界距離（R（0））被定義為受體-供體分離半徑的量，傳送速率等于施主衰變（去激勵）在沒有受體的速率。 換句話說，當供體和受體半徑（r）等于福斯特距離，然后轉移效率為50％左右。 在這種分離半徑，一半的施主激發能量被轉移到通過共振能量轉移的受體，而另一半是通過所有其他可用的方法，包括熒光發射的組合消散。

從概念上講，福斯特臨界距離是供體和受體分子在其下仍然會發生共振能量轉移之間的*大間隔長度。 臨界距離值通常落入范圍為2至6納米，這是偶然許多蛋白質分子尺寸的數量級之內。 此外，該臨界距離范圍也對應于幾個其它生物顯著尺寸，如細胞膜的厚度和分離上具有多個亞基蛋白位點的距離。 R的值（0）（以納米）可從以下表達式計算：

其中κ-squared是描述供體和受體的過渡偶極子之間在空間中的相對方位的一個因素，J（λ）為重疊積分中的供體發射和受體的吸收光譜的區域（與波長用納米表示），η表示介質的折射率，且Q（D）是供體的量子產率。

能量轉移，E（T）的效率，是光子通過被轉移到受主的施主吸收的分數的量度，并且是相關的供體-受體的分離距離 r，通過公式：

和E（T）被評價為：

其中τ（DA）是在受體和τ（D）的存在下，供體壽命是在不存在受體的供體壽命。 因此，通過測定在受體的存在和不存在施主熒光壽命（其表示施主淬火的程度，由于受主），有可能確定分離供體和受體分子的距離。 在許多常用的技術中，能量傳遞效率是由受體的存在和不存在下的相對平均施主熒光強度的穩態測量確定（不通過測定生存期）。

總之，能量轉移的速率取決于供體發射和受體的吸收光譜之間的光譜重疊的程度（參見圖4），供體的量子產率，供體和受體躍遷偶極矩的相對取向，并距離分離的供體和受體分子。 任何事件或過程，影響供體和受體之間的距離將影響共振能量轉移速率，因此使得現象進行量化，只要工件可被控制或消除。

呈現在圖4中為青色熒光蛋白（CFP，供體）和紅色熒光蛋白（RFP或紅色熒光蛋白 ，受體）時比較它們的潛在應用為熒光共振能量轉移對的吸收和發射光譜。 這兩個生物肽吸收光譜被示出為紅色的曲線，而發射光譜表示為藍色曲線。 供體發射和受體的吸收光譜之間的重疊區域是由曲線的底部附近的灰色區域表示。 每當分子的光譜重疊增加太遠，從激發受體哪些信號（產生于供體的激發光照）和供體發射在受體發射信道檢測這種現象稱為頻譜出血或交叉出現。 其結果是，必須從弱受體熒光發射被提取高背景信號。

非輻射能量傳遞的基本理論是直接適用于一個供體-受體對由固定距離分開，在這種情況下，能量轉移的速率是福斯特距離的函數，R（0），而這又取決于κ-squared J（λ），η，和Q（D）中 。 如果這些因素是已知的，供體和受體之間的距離可以被計算出來。 更復雜的制劑是必需的來描述，如多受體生色團和距離的分布的情況。 示于表1中的一系列實驗測量福斯特臨界距離，這是從幾個流行供體 - 受體熒光團對的光譜重疊確定。 因為變量包括施主quantium收率和光譜重疊的程度，這兩者都取決于局部環境條件，福斯特距離值應相同的實驗條件下的那些來探討共振能量轉移下來確定。

能量傳遞介質的折射率，通常從溶劑組合物已知的，或可估計為一個特定的大分子，并且通常取為在水溶液中1.4。 供體的量子產率是通過比較與已知的量子產率標準確定的熒光。 由于Q（D）出現第六根R的計算（0），在Q（D）的值小錯誤或不確定性不會對福斯特距離計算有很大的影響。 還由于第六根依賴性，R（0）未很大程度上受以J的變化（λ），但重疊積分仍然必須為每個供體-受體對評價。 在一般情況下，更高程度的供體發射光譜和受體的吸收光譜之間的重疊產生較大福斯特臨界距離值。

在評價取向系數的不確定性（κ-squared）已在文獻中廣泛討論，盡管實驗證據表明，福斯特理論是有效的，并適用于距離測量，該變量繼續是有些爭議。 要認識到福斯特距離為κ-squared，2/3（0.67）典型的動態平均值的假定值通常給它是重要的。 這假定從供體和受體的方向隨機值結果進行旋轉擴散之前，能量轉移。 取向因子取決于在供體發射偶極子和受體吸收偶極的空間相對取向，并且范圍可以從零到4的值1對應于平行過渡偶極子，而4個結果值從偶極子都平行線的和。

因為第六根關系到福斯特距離，在取向因子為1至4的變型只產生在所計算出的距離的26％的變化，和35％的*大誤差是可能的，當為0.67的習慣假定值是應用。 如果偶極恰好彼此垂直和相應的κ-squared值取向的*嚴重的潛在的錯誤結果變為等于零。 幾種技術處理的不確定性已經采用，包括一系列的靜態取向存在和熒光團的激發態壽命期間不改變的假設。 熒光各向異性的供體和受體的測量可以允許為κ-squared變化來確定極限。 此外，利用具有低熒光偏振（由于從幾個重疊躍遷發射）的熒光團的減少在取向因子的不確定性。 κ-squared以這種方式的可能值的限制減少了潛在的距離計算誤差到大約10％左右。

在許多情況下，取向的因素是困難的，如果不是不可能的，以確定與該變量的精確值往往被視為一個難以克服的問題。 然而，一些證據表明該因子在共振能量轉移計算的重要性的限制。 利用共振能量轉移光譜和X射線衍射技術供體和受體的距離比較很大程度上支持假設的0.67的值的系數（所建議的福斯特理論），至少對于小肽和蛋白質的有效性。 更多的不確定性存在較大的蛋白質。 使用這種價值取向的因素是，這兩個供體和受體的探針可以自由地進行無限制的各向同性運動的假設下有效。 進一步的理由是從實驗證據獲得，對于附接由一個單鍵或雙鍵與大分子的熒光團，供體和受體的節段性運動傾向于導致動態隨機取向。

為松散結合的熒光染料，圍繞單鍵自由旋轉運動應使用的平均取向值的，但分子通過多個連桿站點約束的自由運動可能不會發生。 另一方面，零和4κ極值-squared所需要的供體和受體，這種情況是不可能達到的完整熒光偏振。 統計計算已經提出了一些調查人員認為供體 - 受體分布距離和方向的確定所觀察到的平均距離。條件是在觀察到的距離的一些分布（這不是由供體和受體過于靠近相對于R（0）的限制），可以確實地得到熒光團之間的平均距離和不確定性，由于評估取向系數。

取向因子對供體發射偶極和受體吸收偶極（圖5中示出）的相對取向的依賴性（κ-squared）是由下式給出：

其中，θ（t）是供體的發射躍遷偶極和受體的吸收躍遷偶極，θ（D）和θ（A）之間的角度是這些偶極子和載體接合供體和受體之間的角度，并Φ是含有兩個過渡偶極子平面之間的角度。

能量傳遞效率是*敏感的距離變化時，供體-受體的分離長度接近福斯特距離（R（0））的兩個分子。 圖6示出了轉印效率和分離的供體和受體之間的距離的指數關系。 效率急劇增加到100％，因為分離距離減小到低于R（0），反之，減小到零，當r大于R（0）。 由于距離上的轉移效率強（第六功率）的依賴，給體 - 受體分離距離測量是*可靠的當供體和受體半徑的二分之一在于福斯特距離之內。 當r是約50％的R（0），共振能量轉移效率為接近*大和距離較短，不能可靠地確定。 當供體-受體距離的50％*過了R（0）值，曲線的斜率是太淺，更長的間隔距離都沒有解決。

知道臨界福斯特距離的實際意義在于，值提供到可以由FRET對于給定的一對探針來確定分隔距離的范圍內的導向器（見表1）。 因為能量轉移測量到的距離的變化非常敏感，當供體 - 受體距離是靠近福斯特距離，所述目標分子相互作用的大致尺寸是在選擇的熒光染料對*重要的因素。 應該考慮的，取決于是否穩態或時間分辨測量也在進行中的其他因素，包括化學穩定性，量子產率，以及熒光團衰變壽命。 因為沒有內部距離參考存在對于常見熒光共振能量轉移技術，走距離計算通過測量轉移效率是相對于福斯特距離，這是從在供體 - 受體對測量光譜數據導出。

由福斯特機制共振能量轉移的現象是在其產生的效果在一些方面復雜的，但簡單和可靠。 福斯特距離是從供體和受體的光譜特性準確預測的，并且由于沒有例外的理論尚未被確定，共振能量轉移可以假設將施主 - 受主分子對緊鄰任何條件下進行。 在該理論描述偶極轉移產生的復雜性轉移機制本身，不是因為，但由于距離分布（包括非隨機分布），以及供體和受體分子的擴散發生。 當以平均距離在一定范圍內的幾何形狀和時限的能量轉移的依賴正在采取措施，FRET是一種可靠的技術相互作用的分子間的空間分布研究。

FRET技術在光學顯微鏡的應用

顯微鏡構參數為熒光共振能量轉移的調查與熒光團，標本和成像模式（多個）的要求而改變，但幾乎所有的直立或倒置顯微鏡可以改裝為FRET顯微鏡（見圖7）。 在一般情況下，在顯微鏡應該裝有一個高分辨率（12位）中的冷卻和加強耦合到具有串擾對應密切的熒光團的光譜低水平（*小閉鎖電平）和帶通區域質量干涉濾光器的CCD攝像系統。 探測器的靈敏度決定了帶通濾波器如何縮小可同時也使數據采集繼續以可接受的速度以*小的光譜出血通噪音。 在大多數情況下，一個單一的二色鏡耦合到激發和發射濾光輪或滑應使用，以盡量減少或消除圖象偏移獲取圖像。

從熒光團發射始發上方和下方的焦平面寬視場熒光顯微鏡患有與顯著外的聚焦信號，降低對比度，并導致圖像劣化產生的圖像。 因為產生作為能量共振轉移的結果，固有的低信號電平的這個問題更加復雜的FRET顯微鏡。 數字去卷積技術可耦合到光學切片，以減少或消除信號遠離焦平面，但過程是計算密集型的，可能不足夠快許多動態FRET成像實驗。 激光掃描共聚焦技術可以應用到FRET顯微鏡以產生橫向分辨率一個顯著改善，同時使串行光學切片的收集間隔接近實時。 共焦顯微鏡的主要缺點是激發波長到可用于特定系統，它限制了熒光團供體和受體對在共振能量轉移實驗的選擇標準的激光線的限制。 多光子激發也可以采用結合FRET技術和較少損害由于所涉及的較長的激發波長的細胞。 另外，自體熒光的工件和試樣的光漂白的可能性較小多光子激發的限制激發體積特性內發生。

能夠觀察活細胞中培養幾個熒光共振能量轉移成像圖案的一個典型的顯微鏡結構示于圖7中倒組織培養顯微鏡配備在柱子上的一個標準的鹵鎢燈燈箱以檢查并記錄細胞使用標準的明場，相襯，或微分干涉對比（DIC）的照明。 需要注意的是后兩種對比增強技術可以組合使用與熒光以顯示細胞結構內的熒光團的空間位置。 一個標準的珀耳帖冷卻的CCD照相機系統附連到顯微鏡三目為寬視場熒光和明視場圖像捕獲。

共振能量轉移實驗使用任一廣角照明（電弧放電燈）或實時掃描共焦附件配備有高速尼普科夫盤系統在圖7所示的多光譜顯微鏡進行。 氬氪激光束通過一個聲光可調諧波長設備*濾波傳遞到共焦掃描頭之前，選擇特定的激發波長。 圖像采集采用兩個高分辨率第三代強化的冷卻CCD相機讀獨立通道，并纏繞到主機。 掃描樣品在橫向（x和y）和軸向（z）的平面能夠收集的光學切片的三維圖像重建。 多種圖像處理軟件程序的說明顯微鏡配置兼容。

基于這種現象的根本原則，一些重要的實際點時，應考慮熒光共振能量轉移測量用光學顯微鏡進行：

• 供體和受體熒光團的濃度必須精密控制。 當許多受體分子的環繞單一供體分子發生實現熒光共振能量轉移的統計學概率*高。

• 漂白必須消除，因為該工件可以改變供體到受體分子的比例，并且因此，共振能量轉移過程的測量值。

• 供體的熒光發射光譜和受體的吸收光譜應該具有相當大的重疊區域。

• 應該有用來激發捐助的波長區域的受體的*小直接激發。 在穩定狀態下FRET顯微鏡測量誤差的一個常見原因是供體發射與受體過濾器集的檢測。

• 兩者的供體和受體的發射波長必須與檢測器的*大靈敏度范圍一致。

• 供體的吸收和發射光譜應該具有*小的重疊，以降低供體到供體的自轉移的可能性。

• 供體分子必須是熒光和顯示，以便共振能量轉移發生足夠長的壽命。

• 供體應當表現出低的偏振各向異性的方向的值*小化的不確定性（κ-squared）因子。 這一要求被捐助者，其排放結果從層巒疊激發過渡滿意。

• 當使用抗體標記技術，試劑綴合有供體和受體熒光不應改變其生物活性。 任何活性降低，會嚴重影響所得共振能量轉移測量的有效性。

• 因為熒光共振能量轉移，需要供體和受體分子，以具有相應的偶極對準并定位在10納米彼此中，向其中相連接的分子，必須考慮所用試劑和三級結構。 例如，當供體 - 受體分子可以附著到蛋白質上不同的結構的位置（如羧基或氨基末端），它是可能的FRET不會被觀察到，即使蛋白質不相互作用，因為施主和受主分子位于所述相互作用分子的兩端。

• 標記有綠色熒光蛋白的突變體對FRET調查活細胞應該用傳統免疫組織化學技術，以驗證該標記的蛋白質，采用相同的細胞內的棲息地和屬性與天然對應物進行分析。

為了使熒光共振能量轉移現象，以提供有意義的數據作為在光學顯微鏡的工具，既樣品制備和成像參數必須優化。 適當的供體和受體的探針在它們被用作分子標記的選擇和方式是一個重大的挑戰。 另外，一旦一個標記策略，其允許能量轉移已經闡明，可以使用很寬的技術光譜進行測量本身。 大多數的定量熒光顯微術調查是通過測定熒光發射的強度進行的。 熒光強度為基礎的檢測FRET的通常通過監測變化的發光強度的在對應于供體和受體生色團的兩種波長的相對量來實現的。 當條件合適熒光共振能量轉移發生時，增加受體發射（I（A））是伴隨著在供體發射（Ⅰ（D））的強度的伴隨減少。

雖然在任一施主或受主的相對發光強度的變化可被視為指示共振能量轉移的，習慣的做法是利用兩個值，I（A）/ I（D）的比率，作為衡量FRET。 比的值取決于供體 - 受體對之間的平均距離，是不敏感的路徑長度和體積的激發光束訪問的差別。 任何誘導在分子對之間的相對距離的變化樣品條件生產中的供體和受體發射的比值的變化。 因此，FRET可以在顯微鏡由一個相互作用受體熒光團的輻射增加的供體熒光團和檢測的優先激發，伴隨著供體熒光減少通過由于能量轉移猝滅產生觀察。 FRET的測量采用強度監測方法被稱為穩態熒光共振能量轉移成像。

合適供體和受體探針的其吸收和發射光譜特性的基礎上選擇。 為了獲得*大的共振能量轉移，供體的發射光譜應基本上重疊受體的吸收光譜。 此外，應該有受體熒光的激發*大值的供體的*小直接激發，并且不應該有在其受體發生發光的波長區域的供體和受體之間顯著發射重疊。 在實踐中，它可以是難以識別供體 - 受體對滿足這些要求。 這種情況通常是由以下事實的市售熒光濾波器集是不能完全有效地，只透過所希望的波長，并且光的一小部分的設計通帶外可發送復雜。 除非非常良好表征和控制的表達系統時，供體和受體熒光團的確切濃度可能難以確定。 也可以將所需的自體熒光，光漂白，并且背景熒光的附加校正。

在活細胞中培養的細胞內蛋白質 - 蛋白質關聯的典型調查與細胞凋亡，從順序相互作用的一個復雜的級聯導致細胞死亡的一個physicological過程相關聯的事件表示在圖8。 直接參與的事件鏈的基因產物可以通過熔化，以通過熒光共振能量轉移來探測特定的關聯被標記到熒光蛋白家族的適當部件（在此情況下，BFP和GFP），用于共表達在相同細胞。 參與凋亡的蛋白在線粒體內進行交互，并作為程序性細胞死亡進行結合顯示逐漸下降。 因此，供體發射的圖像（圖8（a））包含來自BFP標記蛋白僅熒光，而相應的受體發射信息（圖9的（b））示出的信號是由于蛋白GFP標記的（與從一定的貢獻供體發射）。 音柱濾波器（如圖8（c）），如下所述，揭示了熒光從兩種蛋白質之間共振能量轉移衍生

之間可能潛在影響的一般熒光共振能量轉移測量的準確度的因素，一些是高度特異性的光學顯微鏡。 在顯微鏡調查的一個主要目標是獲得高清晰度的圖像，這需要特別注意的質量和用來之間的供體和受體的吸收和發射波長光譜區別的濾光器的性能。 為了*大化信噪比（而不會有損試樣或處理被調查），有必要仔細權衡曝光的強度和時間與激發光的供體和受體熒光團的濃度與檢測器效率。 如果供體 - 受體熒光團的濃度過剩，自猝滅可以發生，影響FRET測量的精確度。 漂白是與所有熒光團中的問題，并能影響供體 - 受體的比例，改變熒光測量。 過量照度也可以破壞標本，特別是那些含有活細胞或組織中。

稱為施主光漂白熒光共振能量轉移（pbFRET），它利用了漂白過程以測量FRET的技術，通常是在固定化標本的研究應用。 基于逐像素分析，該方法已被應用到測量標記熒光團綴合的單克隆抗體的細胞表面蛋白之間的鄰近關系。 漂白FRET是建立在理論熒光團是光損傷，只有當它被提升到激發態敏感。 在統計上，分子的只有一小部分是在任一時刻的激發態，因此，熒光團具有較長熒光壽命有患光損傷的概率較高，并表現出較高的速率光漂白的。

支持這一概念的實驗證據表明，熒光團的光漂白的時間與它的激發態壽命成反比。 共振能量轉移的發生降低了供體分子的熒光壽命，有效地保護它針對光漂白。 pbFRET的計算是基于供體的下降速率漂白相對于測定在不存在共振能量轉移的供體。 漂白在FRET研究的測量需要一個相對長的時間內，因而是*適用于固定細胞樣品，其中的時間數據是不重要的，從光漂白對細胞功能的影響是不是一個問題。 在某些方面，捐助漂白技術比致敏的排放測量不太復雜，但擬合的時間常數涉及多個組件漂白曲線提出了一些額外的困難。

能量傳遞效率也可以通過受體漂白技術，其中在供體發射猝滅的改變是通過前值和后選擇性地漂白的受體分子進行比較，測定來確定。 在供體熒光強度的變化在同一檢體區域的分析，之前和除去受體后，有只需要一個單一的樣品制備的優點，并直接關系到能量傳遞效率對供體和受體熒光。

在顯微鏡熒光共振能量轉移的精確測量需要補償所有的潛在的誤差來源。 一個簡單的技術來校正檢測供體熒光與受體發射濾波器和受體熒光與供體發射濾波器（由于交叉或頻譜泄放通）已被開發出來。 該方法還校正FRET對的供體和受體熒光團的濃度的依賴性。 測量策略，這需要一個*小的頻譜信息，利用三個過濾器組的組合，并且可以容易地實現。 供體，FRET，和受體過濾集旨在隔離，*大限度地提高三個具體的信號：熒光捐助，歸屬于FRET受體熒光，并直接激發熒光受體分別。 在實踐中，三種不同的樣品，僅含有供體，只是受主，并且兩個供體和受體進行檢查，每次三濾集，以及算術操作產生的數據以校正交叉和在施主 - 受主濃度不受控制的變化。

示于圖9，分別為交叉的示意圖（光譜泄放通）和過濾串擾，即必須以實現在熒光共振能量轉移實驗的定量結果可以克服兩個顯著問題。 交叉或滲出通過由與圖9中的受體發射干涉濾波器的帶通區域中的供體熒光發射光譜的重疊表現，從而導致供體發射信號（不需要的波長）穿過發射濾波器被發送。 與此相反，過濾器串音描述了*小衰減（阻塞）級以上的兩個濾波器放在一起串聯的特定范圍內，并且是一個令人關注的熒光集匹配的激發和發射濾波器時。 二色鏡通常包括在熒光濾光片組合串擾評估。 盡管2發射濾波器同時很少放置在光路中，頻譜被拉到一起在圖9同時示出了這兩個概念。 注意，這兩個濾波器的光譜（藍色和紅色曲線）表示光透射通過所述干涉濾光器，而供體發射曲線（綠色）是強度對波長的曲線圖。

額外的因素，這可能引入顯著誤差，也需要校正時的穩態FRET測量技術采用。 此外，仔細控制供體和受體熒光團的濃度是可取的。 熒光團濃度測定可以通過時間分辨熒光測量，它提供了獲得平均壽命，而不給體濃度的精確知識的方法，該應用程序被部分地避免。 該技術能夠定量測定的供體 - 受體的間隔距離，并且基于在所述接受體存在和不存在施主壽命的測量。 測量熒光強度衰減作為時間的函數闡明了激發態分子的發射的動態，因此，可以得到大約的供體 - 受體相互作用的性質更詳細的信息。 強度衰減的圖形曲線說明了熒光衰減過程的時間平均詳細信息（參見圖10（a）），采用穩態技術時，這是懸而未決。 測量指示用于平均壽命相同的值，當記錄為穩態強度歸一化到吸收，可以對應于顯著不同衰減曲線的形狀在時間分辨數據圖，表明在所涉及的分子間過程的差異。

熒光團的熒光壽命（τ）是在返回到基態之前存在于激發態的分子的特征時間。 以下的激發光的簡要脈沖表示熒光衰減以簡化的單指數的形式中，熒光強度作為時間（t）的函數，由下式給出：

其中I（0）是立即激發光脈沖之后的初始熒光發射強度，和I（t）是在時間 t所測量的熒光強度。 熒光壽命（τ）被定義為所需的強度衰減到其初始值的1 / e的時間（約37％的I（0）;圖10（a）），并且是速率常數的倒數為從激發態到基態的熒光衰減。

時間分辨與穩態FRET測量的主要整體優勢是，供體 - 受體間距可以映射更大的定量準確。 這導致部分是因為熒光壽命不依賴于局部強度或濃度，并且基本上不受光漂白的熒光團。 熒光壽命，然而，高度到熒光團環境敏感，甚至分子具有類似的光譜可顯示不同的環境條件下不同的壽命。 由于散射不影響熒光壽命，壽命變化的測量可以提供專門與當地的分子過程的信息。

熒光團的壽命受到修飾通過在局部微環境許多變量，包括因素，例如疏水性，氧氣濃度，其他媒體成分的離子強度，結合的大分子，以及鄰近受體分子，可以通過消耗激發態共振能量轉移。 它是一個顯著實際優點，即壽命測量可以作為分子間的相互作用為*指標，并且是獨立于熒光團濃度。

常用來測量熒光壽命兩種通用技術被分類為時間域 （ 脈沖的 ，參見圖10（a））和頻域 （也稱為相位分辨 ;圖10（b））的方法。 時域壽命測量采用脈沖激發光源，并通過直接測量發射信號或通過光子計數檢測得到的熒光壽命。 頻域方法利用激發光源的正弦調制（從脈沖或調制的激光系統獲得），和壽命從熒光發射信號的相移和解調深度決定。 每種方法以熒光壽命成像具有特定的優點和缺點，并且都被廣泛應用到常規廣角，共聚焦和多光子顯微鏡。

示于圖10是表示在時域和頻域技術測定熒光壽命的示意圖。 在時域方法（圖10（a）），試樣是由激光的具有持續時間比激發物種的壽命短得多的簡要脈沖激發，且指數衰減輪廓被測量為時間的函數。 熒光衰減通常是單指數函數的單一熒光，但可以顯示更為復雜的人物，如果激發態在環境中提供眾多的放松途徑。 從連續波激光器耦合到聲光調制器正弦調制光被用來激發在頻域實驗，熒光團（如圖10（b））。 所得熒光發射正弦調制在相同的頻率作為激勵，但是伴隨著相移，并減少調制深度。 在一個單一的指數衰減的情況下，熒光壽命可以通過確定相移（φ），或調制比率（M）的任一的程度進行計算，使用圖10的（b）中提供的等式。如果這兩個值是相同的，熒光衰減是真正組成一個單一的指數函數。 當一個以上的熒光物質是本（或單個熒光團經歷一個復雜的環境中），相移和調制壽命應評估在寬的頻率范圍內。

用于測量熒光壽命的時域技術基本上依賴于單光子計數和要求的檢測系統具有足夠的時間分辨率，以收集接近100％由每個激勵脈沖產生的光子。 雖然相分辨技術相對要求不高執行，他們通常不作為光子計數方法，因為敏感。 當相位調制被用來解決復雜multifluorophore壽命，長的曝光時間，以破壞激發光照可以證明是過度對于某些樣品，并且也可以不提供對活細胞的過程足夠的時間分辨率。 *的技術依賴無論從調查和標本類型所需要的信息，正在研究中。

熒光壽命測量已被證明是FRET的敏感指標，并在因壽命測量的許多因素，如濃度和光路長度，這是很難在活標本，以控制獨立的活細胞的研究特別的優點。 通過熒光壽命測量進行FRET研究的主要優點在于，它可以區分具有相似發射光譜即使供體 - 受體對之間的能量傳遞。 當熒光壽命被直接測量（相對于使用穩定狀態的值），FRET的判斷是可能的，而不供體或受體熒光團的光破壞。 因為FRET通過能量轉移至受體，供體壽命的受體（τ（DA））的存在下在不存在受體的直接比較，可以減少施主分子的熒光壽命（τ（D）） ，使的FRET效率值（E（T）），用于每個圖像像素的計算。

根據該技術，熒光壽命測量所需要的樣品被暴露于高頻重復激發光的脈沖，或以連續正弦調制光。 在與活細胞的研究中，高強度的照明效果，必須始終進行評估。 無論采用何種方法，供體的壽命基準時間沒有接受實驗必須的條件完全相同的供體 - 受體測定下確定。 與單一試樣完成這個的一種方法是以下能量轉移實驗漂白破壞受體的后測量供體僅壽命。

結論

在生物學研究，熒光共振能量轉移的*常見的應用是兩個站點之間的距離的上一個大分子（通常是蛋白質或核酸）或體內生物分子實體之間相互作用的檢查測量。 蛋白質可以帶有合成的熒光或免疫熒光團以用作供體和受體，但在熒光蛋白遺傳學前進現在使研究人員能夠與多種具有不同光譜特性的生物熒光團標記的特定目標蛋白質。 在許多情況下，氨基酸色氨酸被用作內在供體熒光團，其可以耦合到任意數目的作為受主外在探針。

如果大分子都標有一個單一的供體和受體，并且兩個熒光供體激發態壽命期間不被改變的距離，然后在探針之間的距離可以從能量轉移通過穩態測量的效率來確定，如所討論的上面。 在情況下，供體和受體之間的距離波動周圍分布曲線，如蛋白質組件，膜，單鏈核酸，或折疊蛋白（參見圖11介紹的方案），FRET仍然可以用于研究的的現象，但時間分辨壽命測量是優選的。 落入這兩種情況下幾個生物應用示于圖11中，包括構象變化，離解或水解，融合的膜樣脂質囊泡，和配體 - 受體相互作用。

雖然各種方法可用于在光學顯微鏡熒光共振能量轉移的測量中，沒有一個是完全沒有缺點。 有些技術需要更精細和昂貴的儀器，而另一些是基于一定要仔細驗證的假設。 某些方法適合于固定標本，但不能應用到活細胞的系統，而其它方法必須包括顯著糾正計算或數據分析算法。 這是肯定的，但是，FRET分析顯示了在生物應用程序和范圍進一步發展的巨大前景。 在儀表戲劇性的改善已經發生，近年來，特別是相對于時間分辨技術。

熒光壽命測量是只完成了極端困難，在過去，現在由成熟皮秒和納秒的技術援助。 在熒光探針的發展進步產生了更小，更穩定的分子附著生物指標的新機制。 熒光團還開發了具有廣泛的固有激發態壽命，和一個顯著的努力被放置在熒光蛋白的基因變異更為多樣化的發展。 **的類熒光材料，其中有許多是比以前的熒光團更小，允許分子間的相互作用的評價在較低的間隔距離，保證改善標簽的通用性，并導致FRET技術的新的應