免疫熒光（IF）是一種強有力的方法用于可視化細胞內過程，條件和結構。 中頻制劑可通過各種顯微技術（例如CLSM，落射熒光，TIRF，GSDIM）進行分析，根據應用或研究者的興趣。同時，如果已經進行了大量具有至少獲得一個簡單的研究小組的成為不可或缺熒光顯微鏡 。

一個IF試驗的中心是兩個不同的部件的組合：

• 首先，特異性抗體，其用于形成免疫復合物以標記所需的分子 - 在大多數情況下的蛋白質 - 細胞中。

• 其次， 熒光染料 ，其被耦合到所述的免疫復合物，因此在顯微鏡可視化的靶結構。

圖1：本圖顯示了IF與上皮細胞貼壁生長蓋玻片上的間接一個典型的工作流程。培養后，將細胞得到固定，因此殺死用化學交聯劑（如甲醛）。在下一個步驟透用洗滌劑進行，使抗體穿過細胞膜。 阻斷與正常血清，奶粉或牛血清白蛋白減少抗體對非靶結構的非特異性結合，以最小化假陽性信號。接下來，將與第一抗體溫育發生，其特異性識別的表位上的目標分子。在第二孵育步驟中的熒光偶聯的二次抗體施加其結合第一抗體，因此顯示目標結構。 抗體溫育后，細胞核染色用染料如DAPI或Hoechst的其中以插入的DNA進行的。安裝用顯微鏡載玻片上的安裝介質（如的Mowiol?或的Vectashield?）蓋玻片后，中頻準備準備顯微鏡。

直接與間接免疫熒光法

取決于實驗的類型，有兩種不同的IF變種：在直接或初級的IF被連接到一個熒光染料的特定初級抗體用于結合靶結構和它的直接可視化。

在第二變型中，被稱為間接或仲中頻，兩步驟培養中進行。首先，一個特定的主抗體識別的靶結構。然后熒光染料偶聯的二次抗體施加特異性結合的一次抗體。通過引導二次抗體對在其中一次抗體升高的物種（見獲得該特異性的抗體和熒光染料）。兩個IF變種相比，他們每個人都有不同的優點和缺點：

通過耦合第一抗體與熒光染料，直接中頻比間接版本被省略費時洗滌和孵育步驟更快。因此，直接中頻更容易處理，因此，適合于樣品的快速分析中標準化的IF實驗，例如，在臨床實踐中。 然而，有必要采用一種運行良好的一級抗體以高親和力與它的抗原。 這是同時產生負面方面，由于熒光耦合和驗證的初級抗體是昂貴的。此外，需要一個單獨的第一抗體為每個目標的結構，并且該抗體與在直接中頻熒光染料聯動限制在設計實驗相比，間接的IF你的靈活性。

這種靈活性是間接的IF的顯著優勢。一般，幾個不同的目標結構在同一檢體需要在一個被可視化的IF反應，因此離散熒光必須選擇為每個目標分子。在間接中頻，不同的熒光偶聯的二級抗體可與不同的初級抗體（考慮當然的物種的反應性，）相結合。相反，如果你想“玩”與您的目標結構直接IF的色彩組合，您需要為每種顏色單獨的主要抗體。間接方法的另一個優點是由第二抗體的信號放大。多個次級抗體分子可結合于一個初級抗體，從而導致增加的熒光，這意味著較少的初級抗體具有被應用。

間接IF的工作流程可能需要更多的時間，但由于一級和二級抗體一般更經濟的過程中可能的組合是首選大多數研究人員的方法。

圖2：有兩種方法通過免疫熒光來可視化靶結構：在這兩種變體的特定的第一抗體被用于識別在目標分子上的特定表位。 這里，目標分子由幾個相同蛋白質亞基（=宏分子），因此它表現出相同類型的每個亞基的幾個表位。 為了簡化只有一個表位在這里描繪。 
在直接中頻第一抗體直接與熒光染料其中可視化，在顯微鏡下的目標結構。 
在間接中頻熒光偶聯第二抗體在第二孵育步驟中，其特異性標記第一抗體使用。 這導致了更大的靈活性，在選擇的抗體和熒光染料，此外，以信號放大，因為一些次級抗體分子可結合于一個初級抗體。

抗體和熒光染料

為高品質的IF染色的最重要工具是一個很好的一次抗體。 同時，一個或甚至幾個商購的可購買的抗體可用于大約每種蛋白在幾乎每個細胞類型。 但是，也有要注意這里的幾個非常重要的事情。

為了使基于您如果一個嚴謹的科學或臨床聲明染色，你必須確保你的主要抗體與其靶抗原的特異性。這樣做，你不應該完全依賴于你的商業供應商的聲明。根據已使用和驗證在文學上的主題主要抗體選擇你的抗體。檢查制造商的網站抗體的數據表IF染色可用的照片，并將其與您的期望或其他出版的插圖進行比較。取該抗體的克隆性的通知，如單克隆抗體特異性結合僅一個表位，而多克隆抗體識別表位的數，使得非靶結構的非特異性標記的可能性較大。因此，利用它們的高特異性和親和性良好的單克隆抗體通常是更昂貴的，但它們也能達到更好的效果。

如果要執行多色間接中頻，不同的初級抗體必須從不同物種中為了區分免疫復合物通過用熒光偶聯的二抗標記之后推導（見表1）。比方說，例如，你如果與抗體抗蛋白A來自小鼠抗體抗蛋白B兔和抗體抗蛋白C大鼠進行。 當選擇二抗，你要記住，他們每個人的具體承認只有一個主抗體。 此外，在這三個次級抗體的本實施例的熒光染料必須不同于其波長光譜中，以顯微鏡分析鑒別它們的熒光信號。如今，從紫外線鏈接到熒光染料的波長范圍的第二抗體，以從幾乎任何種類是可購買紅外線對初級抗體。因此研究者僅受可用的配置顯微鏡 （過濾套，激發激光器）。

表1：多色間接中頻的本實施例說明了如何在同一細胞標記simultanously三種不同的蛋白質。 三個第一抗體必須從不同物種中，為了檢測其與三個不同的熒光染料偶聯的二抗派生。二級抗體“熒光必須有不同的wavelenght譜明顯分析顯微鏡。在樣本圖像中描繪的細胞也被處理用Hoechst 33342進行核染色。Leica顯微鏡 TCS SP2上執行。

交疊                      蛋白A                  蛋白B                蛋白C

標本

中頻協議，適用于各種不同的樣品或樣品的存在。最簡單和最常用的方法是從細胞培養物中培養（真核）細胞的染色。貼壁生長的細胞可以接種在蓋玻片，多孔-插入或直接在玻璃底培養皿中，并用于中頻處所需的時間。如果還可能的應用的細胞的一個對象的載玻片之后懸浮細胞，例如，通過細胞離心涂片。在兩種情況下，重點是在細胞內過程或結構的分析，而且這是一個指定免疫細胞化學（ICC）。

免疫組織化學（IHC），另一方面，蛋白質或分子的存在被檢體以組織特異性上下文。這里，器官制劑（通常包埋在石蠟）的超薄切片被用于例如研究蛋白在健康器官中的表達相比，患病的。 在另外的組織切片的制備，也可以進行如果與整個生物體，一個過程被稱為“整裝的IHC”。 為了這個目的，不同的模式生物如小鼠，雞或斑馬魚，例如，或植物模式生物像擬南芥的胚胎被使用。 在整裝IHC一個是由試件的尺寸和相關的穿透深度對IF試劑的限制。單獨的孵育步驟的時間比培養細胞的染色更長。 此外，顯微鏡用的大型的標本分析特殊光學設備必須是可用的。

A）                                 B）

圖3：A）一個人腎臟的免疫組織化學（IHC）染色顯示不同結構不同的細胞類型（如Glomerolus，近曲小管，遠曲小管）。 標記有綠色熒光蛋白的表達被限制在一個特定的細胞類型，而紅色標記蛋白被廣泛表達。 
B）Immuncytochemistry（ICC）的圖像顯示兩種蛋白質中通過間接中頻相同類型（MDCK）的細胞染色。 這里，以組織特異性的研究是不可能的，但如果分析兩種蛋白共定位于相同的結構。 兩個樣品進行處理，用Hoechst 33342對細胞核染色。顯微鏡上的Leica TCS SP2的執行。

洗滌步驟

應特別注意的IF過程期間支付給洗滌步驟，因為如果質量可以增加適當的洗滌。PBS是一個標準的洗滌緩沖液，而變體例如PBS ++或PBS-T中也盛行。PBS ++中含有1mM的氯化鈣和氯化鎂，這被推定為具有膜穩定作用防止細胞脫離。為PBS-T的洗滌劑吐溫20的0.5％的終濃度添加有增加的抗體的結合特異性的目的。這是極為重要的應用和吸出洗滌緩沖液小心以免從它們的培養容器或蓋玻片分離細胞。如果你有足夠的時間，讓幾分鐘愿望步驟之間的清洗，以保證洗滌液的有效擴散到標本。單個洗滌步驟的IF程序都列在下面的標準協議。

下面描述常規的中頻反應的各個步驟。一個標準的協議，用于間接IF與培養細胞中最常見的程序連接到這篇文章的末尾。

固定術

固定是一個IF過程的第一步。目標是保持細胞，細胞形態或組織在其當前狀態，并維持該制劑通過化學試劑在延長的時期。期間固定是很重要的細胞結構保持在它們的天然構象盡可能。不同的固定方法是有用的中頻，具有對第一抗體的表位的不同的效果各試劑。抗體結合位點可以被掩蔽或也損壞由固定術，這損害中頻染色的質量。由于每個抗體結合不同，以它的抗原依賴于各種固定化合物，它是必要的，以嘗試幾種固定方式為新的抗體。通常情況下，規范一個合適的固定劑可以在抗體的數據表中找到。理想的固定節約了細胞和亞細胞結構，并提供暢通的抗原良好的抗體結合。在現實中，你必須在兩者之間取得平衡。

固定化試劑可大致分為兩類：化學交聯劑和有機溶劑。

化學交聯劑如通過它們的游離氨基甲醛交聯的蛋白質;細胞形態保存完好，在大多數情況下。然而，抗原也交聯，這可能會減少抗體結合。戊二醛也對細胞結構的防腐劑的效果，但會導致在顯微鏡的試樣（見的高自發熒光控制）。

有機溶劑，如甲醇或丙酮有脫氫作用，沉淀蛋白質，從而固定他們在他們的細胞環境。但請記住，可溶性分子和許多脂質成分丟失在這個過程中。頻繁，甲醇和丙酮的組合被使用時，因為雖然甲醇是最好的細胞結構的保存，其對許多表位產生極為不利的影響。丙酮是損害較小這里。 你也應該考慮到的熒光蛋白如GFP，它們已經出現在你的細胞，將在很大程度上破壞了固定用有機溶劑。如果主抗體的制造商沒有提出固定劑，開始用4％甲醛在室溫下10分鐘是適合于各種細胞系和抗原。

表2：固定試劑。

通透性

由透，細胞內的結構成為它們否則不能穿過細胞的脂質膜抗體訪問。一個單獨的透步驟是必要的，這取決于固定的類型。 當用有機溶劑固定，細胞膜變得已經滲透并可以直接進行攔截。 細胞固定用化學交聯劑需要用洗滌劑進行透化額外處理。經典洗滌劑一樣的Triton X-100或NP-40被施加，但皂苷，吐溫20或毛地黃皂苷也可使用。 再次，不同的結果得到，這取決于所施加的物質，它的濃度和溫育時間，所以應該嘗試不同的參數在開始。典型的啟動表示用0.1％的Triton X-100在室溫下15-20分鐘一個透于PBS中。

如果要分析由IF脂質相關或膜蛋白，你應該進行通透性步驟（=脂肪消除方法）仔細。為此目的一個好的選擇是皂甙，其中選擇性地去除膽固醇從質膜，留下細胞內膜基本完好。如果透被抗體染色前被刪去（只能通過固定用化學交聯劑），可以具體地，為了從細胞內抗原池區分它們標記胞的質膜結合的抗原。核酸染料如DAPI或Hoechst公司（見核染色和樣品安裝）是膜滲透性的，不需要透。

閉塞

阻塞是用于最小化小區內的第一抗體的非特異性結合的一個重要步驟。為了實現這一點，從牛血清白蛋白（BSA）蛋白質，奶粉或血清可以使用。認為這些阻斷蛋白質不從在其中一次抗體升高的物種來源，否則二次抗體的特異性第一抗體將丟失是重要的。 如果使用的第二抗體，例如，一個在山羊抗鼠第一抗體產生，理想的封閉試劑是正常山羊血清。阻斷溶液通常用在1％（奶粉，BSA）的濃度，以5％（正常血清）并稀釋于洗滌緩沖液中。孵育發生在室溫下30-60分鐘。

免疫反應

通過固定，通透和阻塞的樣品制備后，實際的免疫反應發生。將樣品溫育現在與特定一級抗體以標記所需的目標結構。多個初級抗體可以施加在試樣的同時。如上所述，多個初級抗體具有來自不同物種中間接多色IF到起源。抗體稀釋在所選封閉溶液進行的，最初根據制造商。如果你不滿意你的染色，或者如果制造商不提供工作稀釋的任何信息，你應該嘗試的濃度之間的1:50至1：1000。根據抗體的親和力的培養時間可以變化。默認的溫育時間是在室溫下1-2小時; 過夜溫育在4℃下也是可能的。

如果執行直接，如果你能直接繼續樣品安裝，作為第一抗體已經給自己帶來的熒光。在間接如果二次抗體現在熒光標記的初級抗體。這里的一個關鍵的一點是培養與主要抗體后，徹底清洗，以減少二次抗體的特異性結合。第二抗體也可稀釋于封閉溶液或洗滌緩沖液。如果不是由生產表示不同可以用稀釋的1開始：200和溫育在室溫下1小時。有必要進行孵育步驟在黑暗中以防止熒光染料漂白。

細胞核染色和樣品安裝

免疫反應往往是其次是細胞核染色DNA染料。一方面，這使得顯微鏡在細胞或組織切片中的更好取向而在另一則表示蜂窩狀態（例如有絲分裂），如果這是所關心的研究員。染料如Hoechst的或DAPI，它進入細胞核，即使沒有透和插入該DNA，被用于此目的。出于這個原因，你應該非常小心，以避免與這些染料直接接觸皮膚！一個簡單的核染色發生在室溫下，用Hoechst或DAPI在PBS中稀釋10分鐘。

完成中頻過程后，將樣品必須被安裝成適合于顯微鏡。用于此目的的封固劑（如的Mowiol?或的Vectashield?）用于其固定在顯微鏡載玻片上的樣品并且也防止其脫水。此外，安裝媒體提高折射率，這有利于對帶顯微鏡浸油的目標。幾家制造商報價的安裝介質與添加劑如DABCO，抗褪色劑，它從光漂白保護樣本。取決于所使用的熒光染料，一些抗褪色劑是比其他人更有效。此外，安裝是媒體與加入的DNA的染料也可以，以使核被嵌入在染色和一個獨立的核染色是多余的。如果硬化封固劑的情況下，這是經常發生的情況，樣品被允許固化過夜，所以鏡檢能夠翌日。以這種方式產生的永久制劑可以幾乎無限制地儲存在黑暗中在室溫下或4℃，但要記住，在熒光染料“熒光強度減弱隨時間。

圖4：貼壁生長的上皮細胞（MDCK）進行培養蓋玻片上，固定和細胞核用Hoechst 33342大多數細胞表現出相間的DNA染色，但有些細胞顯示染色體縮合而在有絲分裂（星號）走散。 顯微鏡上的Leica TCS SP2的執行。 

圖5：此圖片表明蜂窩微管網絡在成纖維細胞（COS-7）一個間接的IF染色。 進行核染色，用Hoechst 33342和顯微鏡在Leica TCS SP2進行。

控制

至關重要的免疫是您顯微鏡圖像的正確解釋適當的控制。丟失或不正確的控制通常會導致假陽性陳述和不正確的數據。首先，應該分析其只被固定，透并阻止在順序的樣品，以獲得自體熒光的想法 的細胞區室。有時結構出現高度熒光的，即使是沒有染色由中頻。

作為進一步的控制和用于調整顯微鏡參數間接中頻，樣品被用于這也被視為如上所述，但它已被額外地孵育的第二抗體（或多個）。第一，這將揭示一個強有力的非特異性的第二抗體來檢體的結合。第二，在顯微鏡參數被設置使得沒有信號被該控制的圖像采集過程中記錄。該設置被用作閾值用于隨后采集到由次級抗體排除假陽性信號。在直接IF的自發熒光控制提供用于調整閾值。接下來，分析該培養與特定一級抗體并在間接中頻還的情況下與第二抗體的樣品。 這里熒光信號現在應該是可檢測它是自體熒光和第二抗體的陰性對照以上。（奧林巴斯顯微鏡）

為了確保第一抗體只標簽所需的結構，一些制造商提供了一個阻擋肽為第一抗體，其掩蓋了特異性抗原，從而防止所述抗體結合其表位。這是更昂貴的，而且，以確定抗體的特異性，因此，以獲得可靠的結果的最佳方法。在多色IF實驗中，你還必須注意串擾所選擇的熒光染料之間。如果執行多色中頻為第一次，最好是附加地染色靶結構在單獨準備，這些圖像與彩色圖像進行比較。最終，你應該采取一個精明看看你采集數據，并將其與你的期望和現有的數據在同一個初級抗體進行比較。

表3：其中控制測試什么？

限制

如先前所描述的，如果有許多優點，但它也需要一些缺點。一個關鍵點是樣品的固定：固定的手段殺死，所以活細胞成像不再可能。 因此動態過程的分析是復雜的，因為每個時間點的細胞必須被固定和染色。 因此，快速的動態過程是無法觀測與IF。 這顯然是融合蛋白的熒光標記，如綠色熒光蛋白，其適合于活細胞成像的表達的優點。如上所述，在IF程序（固定/透化）改變了蜂窩結構，所以工件可以被解釋為假陽性信號。因此，有必要準備適當的控制對每個IF染色，這可能是費時。另一個缺點是不可避免的：在熒光漂白的。 熒光蛋白質的GFP一樣也受此影響，但是當適當的條件下存儲，GFP即使經過幾個月的籌備永久性的檢測。相反，如果熒光喪失其強度更快，這是由樣品的顯微鏡在快速漂白反射。 即使安裝介質防褪色劑只能暫時在這里幫助。

圖6：在整個過程的流程圖。

標準的IF協議

一個IF過程持續時間：約5小時。

這是一個標準的協議，用于間接中頻蓋玻片上以固定用化學交聯劑培養的細胞。

• 濕盒是完美的IF程序，并可以很容易地自制（見載玻片“如何準備濕盒”）。它防止了制劑的干燥，并允許在黑暗中孵育，這是在處理熒光重要和必要的現有的熒光蛋白質。

• 卷被選擇的方式，將蓋玻片完全潤濕。確保樣品沒有完全枯竭。

• 所有孵育步驟發生在室溫下。

1. 洗細胞兩次，并用鑷子小心地與上翹的細胞蓋玻片到加濕室。

2. 固定用4％甲醛10分鐘，洗3×。

3. 透用0.1％TX-100 / PBS中進行15-20分鐘，洗3×。

4. 與塊5％正常山羊血清/ PBS或1％BSA / PBS 45分鐘（無洗滌必需）。

5. 稀釋的第一抗體在阻斷溶液中，并將其應用為2小時（或過夜，在4℃）。 徹底清洗4×除去未結合的一抗。

6. 孵育1小時，稀釋在封閉溶液或洗滌緩沖液中的二級抗體。

7. 吸出的第二抗體，并且如果需要的話，在PBS中孵育，用Hoechst或DAPI [1微克/毫升] 10分鐘。 洗4×徹底，即使沒有核染色。

8. 就拿蓋玻片輕輕用鑷子蘸成的dh2 O去除洗滌緩沖液的殘留鹽。

9. 提供安裝介質的顯微鏡載玻片上一滴打下與細胞的蓋玻片上這個壓降顛倒。按與鑷子試樣略微使得安裝介質分布良好，無需擠壓樣品。

10. 制備準備顯微鏡固化后。

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  1.對于加濕室的組裝，你需要以下東西：一個塑料盒的蓋子，泡沫塑料的鑲嵌，封口膜一片，一個強大的紙巾，水和鑷子處理的蓋玻片。

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  2.將鑲入禁區，徹底滋潤它。

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  3.將上鑲嵌的封口膜。

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  4.小心地將蓋玻片從與上翹的細胞封口膜培養容器鑷子。標簽蓋玻片的位置，并確保電池永不干涸。

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  5.滋潤紙巾緊緊地跨越它在包裝盒上。要注意的毛巾不觸及蓋玻片。

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  6.將蓋子上盒和毛巾，并培育的細胞所需的時間。

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載玻片：如何準備濕盒。

食譜

洗滌液

• 1×PBS（磷酸鹽緩沖鹽水）

• 137 MM：氯化鈉

• 2.7 MM：氯化鉀

• 10mM的：的Na 2 HPO 4

• 1.8毫：KH 2 PO 4的

• 將pH調節至7.2-7.4，用HCl

• 對于PBS ++添加1mM的氯化鈣和氯化鎂最終濃度

• 為PBS-T加0.05％的最終濃度的吐溫20 
  
  

固定緩沖區

• 甲醛：

• 溶解4％PFA（多聚甲醛）在溫暖（50-70°C）的dh 2 O，在pH值8（用NaOH調節）。

• 添加10×PBS中的1×PBS（如100毫升10×PBS中在900毫升4％PFA / DH 2 O）的終濃度。

• 調節pH至7.2-7.4，用HCl。

• 甲醇（預冷至-20℃）：

• 100％甲醇（-20℃）

• 甲醇/丙酮（預冷至-20℃）：

• 50％甲醇（-20℃）和50％的丙酮（-20℃） 
  
  

通透緩沖區

• TX-100（曲通X-100）：

• 的PBS含有0.1％TX-100的最終濃度

• 皂素：

• PBS中的0.1％皂苷的終濃度

• 其它洗滌劑可以在相同的濃度在PBS中被應用。 
  
  

阻止緩沖區

• BSA（牛血清白蛋白）：

• PBS中的1％BSA的最終濃度

• 奶粉：

• PBS中的1％奶粉的最終濃度

• 正常人血清：

• PBS中的正常血清5％的最終濃度