相差對比是一種光學對比技術，用于在光學顯微鏡下可見的未染色相位物體（例如扁平細胞）。使用相差顯微鏡，可以在高對比度和豐富的細節中觀察明亮度不顯眼和透明的細胞。

使用相移圖像形成

相位物體會導致通過樣本的光的相移。因為只有幅度偏移（強度的差異）對于人眼或光電檢測器是可見的，所以樣本的染色將介導振幅偏移和通過的光的強度差。然而，許多染色試劑對活細胞是有毒的。相差顯微鏡提供了使用由光程長度差異引起的相移，使樣本在光學顯微鏡下可見的可能性。它通過產生的光波的干擾將相移改變為幅度偏移。

相差顯微鏡的技術是在20世紀30年代由荷蘭物理學家Frits Zernike開發的。該技術在1942年投入使用后，Zernike于1953年被授予諾貝爾物理學獎。

使用相移圖像形成

相位物體會導致通過樣本的光的相移。因為只有幅度偏移（強度的差異）對于人眼或光電檢測器是可見的，所以樣本的染色將介導振幅偏移和通過的光的強度差。然而，許多染色試劑對活細胞是有毒的。相差顯微鏡提供了使用由光程長度差異引起的相移，使樣本在光學顯微鏡下可見的可能性。它通過產生的光波的干擾將相移改變為幅度偏移。

相位顯微鏡的技術是在20世紀30年代由荷蘭物理學家Frits Zernike開發的。該技術在1942年投入使用后，Zernike于1953年被授予諾貝爾物理學獎。

圖1a：MDCK細胞，相差顯微鏡              圖1b：MDCK細胞，明場顯微鏡

圖1c：變形蟲變形菌，相差顯微鏡           圖1d：變形蟲變形桿菌，明場顯微鏡

光波的干擾

光路長度是光路中兩點之間的折射率和厚度的乘積。它與運輸時間和光速有關。光路長度的差異導致光波穿過樣本時的不同速度（即相移）。結果發生相位差異。與周圍介質相比，較高的折射率導致光波的減速和相位的延遲。

干擾描述了兩個波彼此的相互作用以及根據疊加原理形成的新波形。光波干涉的相關參數為光波幅值。如果兩個波浪干擾，則所得到的光波的幅度將等于兩個干擾波幅度的矢量和。

如果所得到的波的幅度增加，則干擾將被描述為具有建設性的。如果兩個波峰或兩個波谷在同一時間點相遇，則將是這種情況。另一波的波峰和另一波的波峰也可能在同一時間點相遇。這導致所得到的波的幅度減小。這兩個波浪之間的干擾稱為破壞性的。

相位差顯微鏡中的光路

相差顯微鏡的關鍵要素是環形孔和相位板。環形孔被放置在聚光鏡的前焦平面上，并限制穿透光波的角度。相位板位于物鏡的后焦平面上，并具有由通過它的光調光并使其相位改變λ/ 4的材料制成的相環。λ表示光的波長。

在相位顯微鏡下，在K?hler照明條件下，不與樣品相互作用的光波作為物鏡的后焦平面上的亮環聚焦。光環在光軸上與相位環空間匹配，導致未透光的相移。被樣品衍射的光不會主要撞擊相環，因此不受影響。

在受影響和未受影響的光波之間，總相移高達λ/ 2。未衰變光的相位在相位上提前λ/ 4，衍射光波通常被生物樣本延遲λ/ 4。λ/ 2的總相移允許光波在圖像平面中的破壞性干擾。為了減弱通過相環的未透光，重要的是避免與偏斜光相比未發光的外顯。

如相位顯微鏡觀察到的，λ/ 2的相移產生*大的相消干涉效應，因為波峰和槽在同一時間點有效地達到。因此，光波的幅度減小，相位對象的相移被變換為振幅。

圖2：相差顯微鏡中的光路。通過聚光鏡環的環形光通過聚光鏡聚焦在樣品上。環形光的一部分由樣品（例如質膜，細胞器等）的光密度結構衍射，經歷大約1/4λ的相移（通常用于生物樣本）。該相移并且衍射光繞過相環，并且幾乎不受相環（主要位于物鏡的后焦平面）的影響。相比之下，來自聚光鏡環的直接環形光將撞擊相環，這將使直射光變暗，并引起相移（通常前進為1/4或延遲?λ為正相位對比）。由于由樣品折射的光與通過相位的光之間的總相移將達到1/2λ，將會發生相消干涉。光密度結構將因此顯得較暗（呈正相位對比）。

正負兩種形式的相位對比

相位對比有兩種形式：正負相位對比度。它們主要不同于用于照明的相位板。在正相位對比中，通過相位的光的相位與偏離光相比是前進的，而在相位相位上則呈相位延遲。負相位對比度的相位延遲導致相位差的破壞。光波同相，而不是破壞性干擾，會產生相當大的干擾。這導致所得到的光波的幅度增加。  

在正相位顯微鏡中，具有比周圍介質更高的折射率的物體顯示為比具有較低折射率的物體更暗。對于負相位對比度則相反。

解釋相位圖像

相差顯微鏡顯示樣本的光程長度差異。光路長度與樣品的厚度和折射率有關。細胞結構如質膜和細胞器對光程長度有深遠的影響。許多細胞（特別是在細胞培養物中）具有平坦和規則的形狀，它們在明場顯微術中幾乎看不到。

這種細胞的相差圖像放大細胞結構的差異，并且可以被認為是光密度圖，因為光密度對樣品或材料的折射率有很大的影響。然而，由于不直接依賴于光路長度的差異，因此幾種效應會使相位對比圖像的正確解釋復雜化。

光環效應描述了正相位對比度的明亮邊緣的外觀或大對象周圍的負相位差的暗邊緣。由于來自試樣的一些衍射光也穿過相位環，所以形成光暈。由未形成的波形成的光環比相位稍微小一點，并且來自試樣的低空間頻率衍射光波可以通過環帶。通過相位的偏斜光保持90°的相位差，因此不受破壞性干擾的影響。這導致對比度的逆轉，并導致大對象邊界處的光環。

遮光效果描述了以與周圍介質相同的光強度顯示樣品的均勻部分的情況。盡管通過這些區域的光經歷相移，但僅發生少量衍射，并且散射角大大降低。因此，這些光波如未亮化的光進入相環，不會受到干擾。

相差顯微鏡中的另一個問題可以是對比反演。如果折射率較低的物體與折射率較低的物體相鄰，則它們將顯得更亮，而不是較暗（對于正相位差）。在這樣的區域中，相移不是生物樣本的λ/ 4的通常偏移，而不是破壞性干擾，發生建設性干擾（與負相位相反）。

雖然這些效應可以使相位對比圖像的解釋變得困難，但相位顯微鏡是成像相位物體的一種方便和重要的光學對比度技術。此外，相差顯微鏡可以調查活體標本中的細胞功能和結構，使其成為生物研究中*常用的對比方法。

圖4a：曲霉菌，相差顯微鏡         圖4b：大鼠睪丸，相差顯微鏡      圖4c：菜豆，相差顯微鏡