徠卡顯微鏡通過測量熒光基團位移分析的離子濃度

一個小區的許多基本功能極大地依賴于離子的微妙的，但盡管如此動態結余（如鈣，鎂），電壓電位和細胞的胞質溶膠中的pH值和周圍的細胞外空間。改變這些余額顯著改變細胞的行為和功能。因此，在實時的細胞內離子，電壓和pH動力學的測量對于研究人員在神經科學，細胞生物學和細胞生理學中一般巨大的興趣。在很多情況下，然而，實際的離子濃度或在細胞或蜂窩網絡的不同位置的相對變化的精確估計很難與傳統的熒光的方法。其原因是，這些方法沒有考慮以下事實：在一個小區的不同部分或在蜂窩網絡中的細胞類型之間的細胞形態的差異可能影響其質量和發射的光的量的帳戶。這可能導致重大的錯誤解釋當離子濃度，電壓或pH值的動態變化進行了研究。比例的成像技術，通過觀察熒光團的發射波長變化或通過比較熒光團組合的發光強度，而不是測量光強度的變化繞過這些問題。

離子濃度和pH值或電壓的變化，通過測量熒光團的發射偏移的估計

徠卡顯微鏡研究活動越來越多地把重點放在確定和時空分布如當地的“熱點”中的離子濃度，電壓或pH值的單元格或蜂窩網絡的動態變化。這樣的“熱點”通常定位于細胞的專門部件或在某些小區的蜂窩網絡中。此外，相比于試樣中的細胞代謝或結構方面的其余部分，這些區域通常具有不同的性質。用于研究的動態生理狀態的常規熒光團經離子結合，pH值的變化或電壓變化而改變其發光強度（對鈣結合如熒光4增加排放）。然而，這些標記不考慮在結構，直徑或標記物的攝取/表達的差異可以引起變化的發射光的那是不符合實際的離子濃度，電壓或pH值的相關性的量。定量和同等檢測的變化，蜂窩結構或不同的細胞，不敏感的方法來構造直徑和熒光團的濃度是必要的。而相比之下，非比例的成像方法，比率成像提供了機會，可重復地測量絕對細胞內離子，電壓和pH值/變化相對于細胞直徑，熒光團濃度和成像設置的光學性質。但是，比例成像依賴于激發波長或檢測波長，具有強大的光源，光學元件和快速信號檢測的優異的變速器的快速變化。超快濾光輪，UV光固優化的目標，高度敏感的熒光基團和新的CCD相機的最新發展使得在高空間分辨率實惠的定量高速活細胞成像。

雙波長激發/檢測是關鍵，用于測量熒光團的發射移

如上面所提到的，在比率量度成像的發射偏移僅僅強度變化，而 不是被成像。為了測量發射的變化，熒光團或熒光基團結合的強度的變化，必須使用兩個不同的激發波長或者通過檢測在兩個不同的發射波長的任一測得的。在常用的鈣成像染料的fura-2的情況下，該染料具有被激發光在340 nm和380nm處檢測波長的波長是510納米。在對比的是，鈣成像染料吲哚-1-通常是激發光在350nm的波長和檢測波長為405納米和485納米。

圖1：使用比例鈣指示劑Fura-2從鈣成像實驗的時間推移的快照。描繪的是經過340納米（左）和380納米（中間）的激發和相應的計算出的比率的圖像（右）的假色的圖像。所述圖像系列示出了三個點在時間：在時間的第一點（1）單元，不刺激，細胞內鈣離子是在靜息水平。在第二時間點（2）的細胞受到刺激和鈣是在最大水平。在第三時間點（3）的細胞內鈣水平下降。在該曲線圖在時間上的對應點被標記。上部的曲線示出了340nm處的圖像的強度，中間的圖中的380nm處的圖像和下部曲線圖中，顯示了比強度。

但是，為什么是必要的雙重激發或發射檢測？為什么就不能衡量變化的熒光強度？

定，其中熒光團被用于檢測改變離子的水平，電壓或pH值的實驗，發射的熒光的光的強度取決于幾個特性。這些將在下面的方程式所描述：

F =熒光強度; C =熒光濃度; D =直徑試樣（Z軸）; K =光在光路元件的常數（電池特性，目標，過濾器等）; F（X）介紹，如果如離子結合或發生電壓/ pH值的變化給定的熒光團的發射行為。

該方程表明，該光強度非常依賴于熒光團的光路中的量。熒光團的光路中的量取決于熒光團在細胞和樣品（四）的直徑（通過標記的攝取或表達確定的）（多個）的實際濃度（c）在被成像。這使得它很難直接通過簡單地觀察熒光強度，例如，人們不能狀態估計的研究離子，pH值或電壓變化的濃度：“100強度等于游離鈣在細胞中的100nM的”。試樣直徑（d），熒光團的濃度（c）和檢體和設置（K）的光學特性幾乎沒有可測量的，但基本上影響整體的強度進行檢測。此外，它必須牢記的是，以上所示的公式為真，在檢體任何給定的點。隨著直徑（d）和熒光團濃度（c）是不均質的整個一個試樣，甚至在單個細胞，對c和d的值可能是在被檢查物的所獲取的圖像的每一個像素的不同。如果，例如在點“A”，在樣品中的細胞的直徑是相當高的和游離鈣相當低，光強度可能是相同的點“B”，它是相對的。實驗者然而，可能錯誤地推斷出鈣離子濃度是在這兩個地方相似，作為檢測到的熒光的光強度是類似的。

圖。2：草圖以上是想說明，如果在小區內如鈣濃度是通過一種非比例鈣敏感的熒光團的發射光的強度來判斷可能發生的錯誤解釋。草圖下面的曲線代表光強度的感興趣區域（ROI）中的細胞的不同部分的區域。
在上面的圖像（A）中的細胞在不同的區室像細胞的突起這往往是不同的厚度（四中的表現公式）精細結構（例如樹突和神經元軸突）。作為上述光路內的所有熒光團被激發光激發而其發射的光被收集，小區的較厚部位出現比薄的部分明亮得多。這可能導致的假設，即在細胞中的較厚部分中的鈣濃度比可比較薄部分更高，盡管實際的鈣濃度是相同的。
在下面的草圖（B）不同的情況被示出。在某些細胞類型的熒光團占據的細胞區室之間可能有所不同。在下部草圖的情況下，鈣濃度（三式中的）中的單元格的更厚的部分較高，但在該領域中的熒光團濃度較低。作為鈣敏感染料的檢測到的熒光強度不僅依賴于鈣離子濃度的細胞，而且還對熒光團濃度，人們可能會得到的印象是，在整個細胞中的鈣濃度是相同的。

為了克服這些問題，并為絕對的離子濃度，pH值或電壓的精確測量，比例成像已經研制成功。所有比率的方法的共同之處在于，發射的光的強度被測量兩次，這些強度的比（R）的計算方法。根據不同的熒光團或所用的熒光團的組合，所述熒光團或者是激發光的兩個不同波長和發光強度的測量是在一個波長 - 或熒光團或熒光團的組合是激發光1的波長和發射的測量是在兩個不同波長的光。這只是意味著兩個灰度值的圖像被獲取和一比圖像從它們算出。兩個灰度值的圖像通常有不同的強度，但在圖像中每一個象素的強度可以通過如下所示的公式來描述：

F =熒光強度; C =熒光濃度; D =直徑試樣（Z軸）; K =光在光路元件的常數（電池特性，目標，過濾器等）; F（X）介紹，如果如離子結合或發生電壓/ pH值的變化給定的熒光團的發射行為。

正如其名稱比率成像意味著，對于兩個同時獲得的圖像的每一個像素的比例值來計算。例如，如果非常常用的鈣敏感染料的Fura-2（激發在340nm和380nm處）的情況下，所得到的公式將是：

根據簡單的數學，C，D和K可以被取消，其比例是可以描述為：

虛擬圖像比例是由兩個灰度值圖像計算

在實踐中，該比例是通過一個計算機在一個時間推移實驗計算出的，在許多情況下，聯機。通過計算相應的兩個獨立采集的灰度值的圖像的像素的灰度值的比率，該比率圖像被創建。請記住，灰度值的圖像基本上都是灰度值與相機分辨率的大小或感興趣區域（ROI）的區域的矩陣（通常是512×512，最多不超過1000×1000像素）。在鈣成像時間推移實驗與染料的Fura-2（激發：340納米和380納米，發射：510納米）這會工作如下（假設該圖像具有尺寸3×3個像素）：

圖3：強度讀數值的簡化圖示的CCD照相機可以使用鈣探針呋喃-2傳送到計算機中的鈣成像實驗這一點。在這種情況下，圖像將是3×3像素的大小。上面三個矩陣代表在鈣擱置濃度強度讀數值在340 nm和380 nm激發加上相應的比率值。照片下部三個矩陣表示在高亮像素時鈣升高的亮度值的變化。在340nm處激發的增加值，而在380nm處激發減小的值。然而，相應的比例值也將增加。

執行用于每個圖像對中一個時間推移實驗的每一個像素這一操作，生成的比值圖像棧。最后，以假色圖可以應用到比圖像棧和堆然后可以觀看并定量象正常灰度值的時間推移的電影。

除了上面提到的優點，一個比的計算有一個附加的優點。在進行活細胞成像離子，電壓或pH敏感的熒光，熒光強度在相應波長的微小變化經常發生。在比成像，但是，強度的增加在一個波長和強度降低，在其它波長是在大多數情況下，觀察到的（不管探針是否被激發或用兩個波長檢測）。如果這兩個獲得的圖像的比例，隨后計算，基線和信號振幅之間的差會相對于熒光團的光強度變化被增強。因此，比成像放大檢測到的信號的振幅。這是為熒光共振能量轉移測定法特別感興趣，這里的受體蛋白質的下降的熒光強度和能量傳輸過程中的受體蛋白質的增加的熒光強度。