徠卡顯微鏡在鼠耳真皮的熒光免疫

炎癥和重塑過程的活體成像一直是一個重要的研究領域，并還激發了創造表達的熒光蛋白轉基因無數記者小鼠模型。我們的論文描述了一種新的體內成像技術，它的設計是基于使用免疫染色對外科手術暴露的小鼠真皮活細胞和組織結構，而不會引起有害的免疫毒性作用的創新概念。在外科手術過程本身是安全的真皮脈管，因為它僅依賴于兩個皮膚層在耳朵被獨立地支配，通過血液中自主供給和由分離淋巴環流排出分離。

結果 

**為止，免疫染色在活組織中通常不使用，由于形成免疫復合物，導致高背景染色和免疫毒性。我們克服由預阻斷的組織巨噬細胞的Fc受體結合，從而“致盲”這些細胞對隨后的間接強免疫染色這些大的問題。由于該標記是細胞外，我們控制強的光毒性和漂白通過組織中的天然抗氧化劑浸泡，抗壞血酸（圖1）。

圖1：真皮活體染色和實時成像，可以Fcγ受體阻斷和抑制光毒性后。 （a）該耳的小后部區域首先接觸（虛線框），染色Lyve1并與第二抗體進行檢測。接著，將整個耳朵被曝光后，阻止不相關的免疫復合物進行15分鐘，并探討了如前。頂部邊界：無Fcγ受體阻斷，從一級和二級抗體之間形成并結合Fcγ受體對組織居民免疫細胞的免疫復合物高的背景效果。底部小圖：該背景主要是去與預先阻擋Fcγ受體的。 （二）光漂白*小化通過添加抗壞血酸，抗氧化劑，以林格氏緩沖該成像期間沐浴的耳組織。組織染色用抗IV型膠原蛋白和鏈霉親和的Alexa647（紅色）生物素化的抗體，然后不斷地成像為300秒中任一未改性林格氏緩沖液（上圖）或抗壞血酸鹽林格氏（下圖）;證明光漂白的程度，對像素強度值的亮的25％顯示為綠色（“高”）。需要注意的是抗壞血酸的保護效果可低估作為單個曝光時間為林格（對照）為227毫秒，而曝光時間為抗壞血酸是427秒。 （三）熒光衰減的定量隨時間（以林格氏對5％的抗壞血酸林格氏30％），歸一化到初始熒光，平均為3攝像視場;標準誤差示由虛線和P<0.0001兩線之間。比例尺中，200微米; B，50微米。

我們還通過染色對基底膜的標記，如實施的方法，所述組織微環境與血液和淋巴管，周細胞，神經，肌肉和脂肪細胞的特定成像IV型膠原，而不是從非結構性纖維膠原成像的二次諧波信號，基底膜蛋白。我們提出的實驗裝置的詳細的設計和細節進行成像的一系列重要的生理活動*過12小時，包括血液和淋巴管之間白細胞運輸。我們還實現這種技術用于成像腫瘤細胞浸潤和轉移，以及免疫細胞歸巢至腫瘤（未示出）。這些事件可以成像與同時記錄當地的生理參數，如血管通透性和淋巴引流。活體免疫重要的還可以外趨化因子的商店與細胞遷移的事件相關聯。 

因為耳真皮幾乎是二維的，我們可以很容易地收集，而不是更慢和更昂貴的共聚焦或多光子顯微鏡用熒光立體顯微鏡（圖2）這樣的數據，。在徠卡熒光立體顯微鏡主要光學嵌入顯微鏡支架，這會導致從16到320倍線性放大率內。在該系統中，透鏡的主要功能是在同一時間使透鏡的工作距離是相對大的，收集的光的*大量（對于2X透鏡它為2cm的工作距離）。這與全自動化相結合的階段，導致操縱和成像通常允許一個以上的耳朵在一次實驗成像的舒適度。

圖2：在手術暴露耳朵背真皮血液循環的功能。 （一，二）明視場圖像，顯示血液循環（一）手術后立即（二）20分鐘，在相同的耳，其中，循環中的所有主要血管出現完全恢復之后。 （三）Lyve1染色（在不同的耳朵）示出了淋巴管的網絡，其中，所述耳部的前部不能與寬視場徠卡顯微鏡成像由于皮下組織的下層脂肪組織。 （四）TRITC葡聚糖通過淋巴管引流功能。 TRITC葡聚糖是在被染為IV型膠原的背部皮膚的頂皮內注射。血管中的露出真皮（e）條的功能作為可視化與血管內TRITC葡聚糖（紅色）表示損壞的血管（箭頭），該泄漏葡聚糖進入間隙空間。 （六）血管通透性的靜脈后，IV型膠原染色耳組織評估注射155 kDa的TRITC葡聚糖。 （六）泄漏用30分鐘（Ctrl鍵;頂部）的基礎水平和在加入1μg/ ml的VEGF-A的（底部）后的同一組織中。 （克）的熒光強度，在血管外空間中作為時間的函數，表示血管滲漏的量化相對增加。示出的是平均值（三角形和正方形）和10的攝像視場的標準誤差（虛線）。 P<0.0001兩線之間。以下圖片來自同一實驗（由分號隔開）：圖。 1a和1b;圖。 1C;圖。1D;圖。 1E;圖。 1F。比例尺中的a，b，和c2毫米; D，F，100微米;即，500微米。

在我們的出版物中，我們比較我們的技術，*設備，**的活體成像的各個領域的標準。因此，我們觀察到前面描述的血管外滲和各類白細胞的免疫細胞進入收集，而不是初始的淋巴管的**的可視化淋巴血管內的事件。我們還發現從原位移植黑素瘤轉移細胞遷移的主要模式（未示出）。我們表明，在體內，CCL21是能夠形成于收集，但只有很少的初始淋巴強，不連續的沉積。這是耐人尋味的，因為收集容器有*新的被忽略，因為免疫細胞進入潛在門戶網站。事實上，我們發現，皮膚樹突細胞和粒細胞能進入收集淋巴管，觀察，不僅增加了位于集熱器的不連續的CCL21補丁的發現生理重要性，但它也可能在淋巴和CCL21的生物學切換模式作為血管內到這種類型的船只都未曾觀測到。多么重要的發現可能是事實，非常類似我們的，但補充的觀察以及初始淋巴管弱，連續CCL21趨觸性梯度*近發表在科學韋伯等人。我們的紙補的Weber等人的研究，因為我們提供了一種可能的解釋為對相比，收集那些初始淋巴強CCL21的沉積物相對不頻繁的定位。我們懷疑淋巴集熱器具有豐富的串珠素的存在和集聚蛋白的蜱基底膜，通過淋巴源性CCL21遇到的*個組織受體，是在捕獲肝素 - 結合的趨化因子相比，由基底膜弱支持初始淋巴管（圖更好3）。

圖3：現場染色只檢測外基底膜結合CCL21，而固定的組織染色上揭示了細胞內和細胞外CCL21。 （A-B）在活耳真皮CCL21在補丁（箭頭），并沿連續淋巴節段（箭頭）積累，和共定位用（一）串珠素和（b）IV型膠原，收集淋巴的兩個基底膜成分船只。 （三）偶爾觀察到CCL21陽性（綠色）初始淋巴管（ILY）染色更弱為IV型膠原蛋白（紅色）。 （四）外CCL21存款（綠色）看到周圍的露耳的皮膚淋巴管沒有與血管損傷相關領域，如通過靜脈確定TRITC葡聚糖（青色）可見，從受傷的血管（箭頭）組織染色的串珠素和CCL21后的區域泄漏。比例尺中的a，b和d（左），400微米; c和d（右），100微米的。

討論 

這種方法應該是有趣的和有用的科學界，特別是在微循環，免疫學和腫瘤微環境，包括對腫瘤的血管生成和抗血管生成治療的研究領域。它具有一些優于其它活體成像技術：（ⅰ）活體熒光成像已經被用于在微循環研究，例如，從血液或淋巴管進入跟蹤溶質滲漏，但還沒有被結合的免疫染色。 （ⅱ）利用遺傳修飾的報告小鼠的允許為特定的細胞類型，以進行成像，但要求它們的可用性（或大量的努力，以生成新的），并限制了可研究相互作用的細胞類型的數量。 （ⅲ）細胞外基質可以被成像在利用二次諧波生成的體內，但是這僅僅限于纖維狀膠原，留下大量的像基膜，纖連蛋白或生長因子和趨化因子結合的糖胺聚糖夠不著對當前研究的重要基質。我們的方法克服了所有的這些限制，并進一步允許引入標準的成像技術以及進一步與免疫染色為其他類型的細胞，組織結構，趨化因子的存款，或胞外基質蛋白，而同時跟蹤血液或淋巴流。*后，這種方法受到重視它出版之前。該圖像示出黑素瘤細胞侵入淋巴活集電極船只被選擇作為自然綜述文章的封面圖像“跟蹤轉移和欺騙癌癥”。 

總之，這活免疫橋接實時，生理功能與在皮膚復雜的細胞事件的分子成像本地測量。此外，這種方法具有更大的潛力，因為它可以很容易地應用到如研究了血液和淋巴血管生成后的發育機制，移植排斥反應的實時成像，或通過各種致病體可視化的皮膚感染的早期階段。例如，我們正在整理，其中通過使用這種活法，我們確定了線蟲感染和進入淋巴管機制的手稿。我們也分析了在轉移和血管生成的腫瘤的細胞外基質的異質性的效果。憑借其靈活性和高通量的潛力這活技術，可以徹底改變生物學的多個領域。