徠卡顯微鏡EM樣品制備

由于在電子顯微鏡的對比度主要取決于在小區中的有機分子的電子密度的差異，污漬的效率是由附著在生物結構污漬的原子量來確定。 因此，使用最廣泛的污漬在電子顯微鏡是重金屬鈾和鉛。 盡管單獨使用這些污漬中的一個可能是相當實用的常規用途中，當這兩個污漬中使用的序列，“雙反襯”，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，獲得最高的對比度。

介紹

因此，在網格上以乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛超薄切片的二重造影法的標準例程反襯技術用于電子顯微鏡。 雖然這種技術是眾所周知的對比是樣品制備用于電子顯微鏡中最關鍵的步驟之一。 除了人工處理，所用的化學品特別的屬性，這可能會導致沉淀的人工制品，都是錯誤的因素。

醋酸雙氧鈾（UA），這增強通過相互作用的對比度與脂質和蛋白質，形成一個黃色的針狀晶體析出，如果在右濃度，如果多余的UA不從部分除去未使用。 的檸檬酸鉛，它通過與蛋白質和糖原相互作用增強了對比度，會形成水不溶性有毒的白色沉淀（碳酸鉛），如果不是無二氧化碳排放的條件下嚴格使用。 避免的 CO 2中的手動過程是困難的其中一個特殊的過程是必要的。

再現性的科學需求，具有低試劑消耗在一側和安全的工作條件通過避免與在另一側的危險試劑接觸的要求高品質的樣品可被滿足，以標準化的，封閉的和自動化的過程。

根據這些要求，徠卡顯微鏡開發的全自動徠卡EM AC20。 自動對比與現成的預包裝UA和檸檬酸鉛染色確保與試劑的最低用戶聯系，并消除了人工染色幾乎所有的傳統問題，如鈾和鉛的沉淀，健康風險和高試劑消耗。

漬

在電子顯微鏡中最廣泛使用的污漬是重金屬，鈾和鉛。 超薄切片用醋酸雙氧鈾（UA）和檸檬酸鉛雙重造影法的標準對比技術用于電子顯微鏡（圖1和2）。

在本章中，我們將討論UA的特點和檸檬酸鉛及其優點和根據對比過程中的缺點。

圖1：在水絲蚓屬的環帶區腺細胞顆粒。                    圖2：水絲蚓屬的縱向肌肉。

醋酸鈾

UA（圖3）的優點在于，它產生最高的電子密度和圖像對比度，以及賦予細晶粒的圖像由于鈾238的原子量。 鈾酰離子結合的蛋白質和脂質與唾液酸的羧基基團，例如糖蛋白和神經節苷脂和核酸的DNA和RNA的酸式磷酸酯基團。

圖3：市售的黃

神經節苷脂是糖脂和集中在細胞的表面上。 糖蛋白中富含所有膜和多糖包的一部分。 因此UA傳遞膜，核酸以及含有蛋白復合物的核酸，如核糖體的良好的反襯效果。

從左至右依次為：醋酸根離子，鈾酰離子，醋酸鈾結構式

UA的缺點是它的光，特別是紫外線的靈敏度，并且將沉淀物如果暴露。 老化時，也沉淀。 此外，UA是既放射性和毒性。 從貧化鈾制成的正常商業股有0.37-0.51微居里/克典型的放射性。 這是放射性的一個非常溫和的水平，是不充分的有害同時該材料仍然是外部給體。 如果食入，吸入粉塵或皮膚接觸，如果皮膚被切斷或磨損是非常有毒的。 該毒性是由于化學毒性和輕度放射性的組合效應而存在的，從長期接觸累積效應的危險。

醋酸鈾解決方案

UA正在使用，也可以作為醇（乙醇或甲醇）或水溶液。 這兩種類型的雙氧鈾溶液有個別的優點和缺點。

酒精醋酸鈾

醇污點的優點是，它會更容易地滲透到塑料包埋的組織，從而得到高對比度，只需要很短的染色時間。

醇溶液的制備通常是在50％-70％乙醇或無水甲醇中的飽和溶液。

在甲醇中，得到最高的溶解度。 因此，可能的最高對比度由飽和甲醇乙酸雙氧鈾染色給出。 
酒精，特別是甲醇的醋酸雙氧鈾是化學侵蝕性的溶液。 因此，多孔材料的增強抽出應使用甲醇醋酸鈾時予以考慮。 酒精UA溶解colloidin-parlodion支持膜，如果染色時間可以延長，甚至溶解膜聚乙烯醇縮甲醛。 它也有許多塑料和橡膠產生負面影響。

水醋酸鈾

為了獲得UA的污點的具體作用，它應當作為一個水溶液。

當UA正在溶解在水中，將溶液的pH值的范圍為4.2至4.9視濃度（0.5％?3％）。 在此pH下該雙氧鈾物質與正電荷支配和染色液給出一個足夠的對比。 帶負電荷的分子，如核酸，污點特別好。

水性污漬是不穩定的，也很光敏在此pH范圍內。 老化的溶液和光照射的引線和四價鈾的氫氧化物既鈾氫氧化物沉淀。

四價鈾也沉淀在某些有機離子，如包埋介質的未聚合的單體存在下，如下所示：

因為污漬具有較低的pH值，不推薦用于與樣品是不穩定的在酸性條件下使用。 另外，色斑沉淀在生理pH下，在許多的鹽和非常謹慎的存在下使用時是需要的。 因此，過濾的污點應在4℃下儲存在暗處且可用于數個月。

穩定的解決方案

UA的穩定是必需的，以避免沉淀更長的存儲時間。 沉淀可以在UA被酸化穩定完全避免。 酸化然而，大大降低了染色效果。 在pH 3.5鈾離子的附著于DNA是強，也比在pH4.0更具體的，因為在該pH僅DNA具有負電荷。 在pH低于3.5雙氧鈾染色將反應非常弱的組織成分，因為大多數的蛋白質甚至核酸不再是在較低pH值下帶負電荷。

徠卡Ultrostain我（醋酸鈾溶液）

徠卡Ultrostain我對應于一個穩定的0.5％，pH為4.4乙酸雙氧鈾溶液。 它是預先裝在棕色200毫升瓶以保護其免受光。 這是在一個特殊的風險實驗室化學品生產廠，這是幾乎不可能安排在一個EM-實驗室條件下。

沉淀

在常規的對比過程，這些問題具有UA都比較容易被染色的反復更新，通過日常的過濾或離心分離來掌握。 在UA結晶在大正方形或菱形形成的晶體（或作為粒狀骨料，圖4）的針。

圖4：醋酸鈾沉淀

4％的制劑的含水醋酸雙氧鈾（重量/體積）原液

注意：醋酸鈾是非常有毒的，由于化學毒性和輕度放射性的組合效應而存在的，從長期接觸累積效應的危險。運動保健稱量粉末，總是戴乳膠手套，實驗服，防護面罩和其他適當的保護（接觸實驗室安全員！）

物料

• 乳膠手套，實驗服，防護面罩

• 200毫升粗漿瓶（嚴格干凈！）

• 百毫升容量瓶（嚴格干凈！）

• 50毫升移液管（嚴格干凈！）

• 在通風櫥中的平衡

• 稱量皿

• 熱板

• 磁力攪拌器和攪拌棒

• 的Whatman＃1濾紙

• 玻璃漏斗

• 醋酸鈾二水粉（貧）[U（C 2 H 3 O 3）2×2H 2 O]，4克

• 無二氧化碳排放雙蒸水，125毫升

注意：一旦玻璃器皿被污染的重金屬污漬它不應該被用于制備其它化學溶液。

程序

1. 權衡將4克醋酸雙氧鈾（UA）在通風櫥下（磨損保護！），并將其添加到100ml容量的燒瓶中。 吸管96毫升近沸點的CO 2 -free雙蒸水與UA的燒瓶中。

2. 放在攪拌器，直到醋酸鈾水合物晶體溶解。 這將需要一段時間。 后溶解讓溶液冷卻至室溫。

3. 通過的Whatman＃1過濾到200 ml棕色瓶（避光），并蓋緊瓶蓋和標簽過濾器的UA。 此原液可存放數月，在4℃。

4. 沖洗受污染的玻璃器皿放入廢瓶UA解決方案，并從實驗室玻璃器皿單獨存放。 被污染的UA固體廢物應以固體廢物的容器留出放射性廢物處置（接觸實驗室安全員！）。

檸檬酸鉛

檸檬酸鉛增強了廣泛的細胞結構，如核糖體，脂質膜，cytoskleleton和細胞質的其他車廂的對比效果。 的對比效果的提高依賴于具有降低的鋨的相互作用，因為它允許鉛離子的附接至分子的極性基團。 鋨常規地用作固定劑。 檸檬酸鉛也相互作用，在較弱的程度上，與UA，因此導致UA染色后檸檬酸染色使用。

檸檬酸鉛的缺點是它的實驗室條件和耗時細膩制備下不可預測的行為（參見圖7）。 檸檬酸鉛容易析出在二氧化碳的存在下，或者在空氣中或在用于制備污漬或漂洗水。 碳酸鉛（PbCO 3）是一種不溶于水的有毒的白色沉淀物，因此不會在漂洗水中溶解。 一般來說所有的鉛鹽如檸檬酸鉛是劇毒的。

領先的解決方案

鉛檸檬酸結構式

鉛溶液的染色效果是高度相關的，如雙氧鈾溶液，在溶液的pH值。 不像鈾，但是，它有可能使用含鉛染色溶液在非常高的pH值（> 12 pH下）。

堿性Wenable＆Goggeshalls和雷諾的領先解決方案是最流行的。 通過這些方法，即雷諾（1963）更可靠的日常工作，僅僅是因為檸檬酸鉛的商業品質并不總是符合要求的染色質量。 在雷諾數方法，檸檬酸鉛形成為從檸檬酸鈉和硝酸鉛之間的反應產物。

所有的堿性鉛污漬可以被認為是穩定的解決方案。 因此，這些解決方案是適合于商業處理，只要它們能消除碳酸鉛形成的條件下進行。

徠卡Ultrostain II（檸檬酸鉛溶液）

徠卡Ultrostain II對應于雷諾檸檬酸鉛。 3％的檸檬酸鉛溶液預氦氣氛下真空密封袋包裝。 這是根據極度小心完成在化學生產廠在一個特殊的風險實驗室，并在其中是不能夠實現在一個標準的EM-實驗室條件。

沉淀

碳酸鉛（PbCO 3）是一種不溶于水的有毒的白色沉淀物。

它顯示為黑色顆粒的電子顯微鏡。 顆粒可以是大的（圖7a）和少數或部分可被覆蓋有細沉積物（圖7b）。

圖7A                                    圖7B

注意：鉛鹽是劇毒的。 在加權粉末小心。 佩戴合適的防護。

物料

• 50毫升量瓶中，用塑料或玻璃塞（嚴格干凈！）

• 25毫升移液管（嚴格干凈！）

• pH計（嚴格干凈！）

• 磁力攪拌器和攪拌棒

• 鉛硝酸鉛[Pb（NO 3）2]，1.33克

• 檸檬酸鈉[娜3（C 6 H 5 O 7）×2H 2 O]，1.76克

• 無二氧化碳排放雙蒸水，加入100毫升（新鮮制備并冷卻到至少25℃）

• 1N的NaOH，將10毫升（以CO新鮮制備的2 -free雙蒸水）

程序

1. 結合1.33克硝酸鉛，1.76克檸檬酸鈉和30ml無二氧化碳排放雙蒸水在50ml的容量瓶中。 搖動溶液劇烈幾分鐘，然后5-6倍，在30分鐘的時間。 這將產生鉛染色的乳白色懸浮液，不含大的顆粒。 如果人們看到大段大段，繼續搖，直到顆粒被分離，或重新開始。 攪拌在攪拌板上直到乙酸雙氧鈾水合物晶體（圖3）被溶解。 這將需要一段時間。 后溶解讓溶液冷卻至室溫。

2. 加5?7毫升1N的NaOH，以懸浮液中，同時攪拌。 乳白色的解決方案應該把清晰。 如果沒有，添加一些滴氫氧化鈉高達總8毫升。 如果解決方案仍無法啟動清楚，什么是錯的污漬應該被丟棄！ 沖洗受污染的玻璃器皿放入廢瓶UA解決方案和存儲分離的實驗室玻璃器皿。 被污染的UA固體廢物應以固體廢物的容器留出放射性廢物處置（接觸實驗室安全員！）。

3. 撤回少量清晰染色并用pH計檢查pH值。 pH值應為12.0 +/- 0.1。 如果pH值太低，添加更多的氫氧化鈉向澄清溶液中步驟2的燒瓶中，如果pH高于12.1開始。

4. pH值已通過驗證之后，無二氧化碳排放的水添加到量瓶中以使溶液于50 ml的終體積。 該瓶應嚴格塞住。

5. 該解決方案具有保質期可達6個月，如果封得嚴嚴實實。 在使用前，離心（5000×克/ 10分鐘）或通道通過微。

注意：確切的pH值是這個污點極其重要的。 如果pH值超過0.1單位的pH從12.0變化，會發生染色差或沉淀。

對比過程

手冊反襯

在標本電鏡的準備，部分的手工染色，其中大部分故障都經歷的步驟。 這里，柵格被置于乙酸雙氧鈾（UA）的溶液滴并除去后，在一定的溫育時間與鉗（圖8a和8b）。 然后柵格被置于檸檬酸鉛對孵化滴之前在水中沖洗幾次（圖9a和9b）。 為了防止檸檬酸鉛通過暴露于CO 2的沉淀，氫氧化鈉顆粒加入到染色皿中（此處的皮氏培養皿）中排除大氣中的CO 2。 另外，漂洗水應CO 2 -free（雙蒸餾）。 染色后，該網格中的幾個熱水浴中并且通過使用水（圖9c）的射流再次漂洗。 芯吸和干燥后，網格可以被分析。

人工染色過程的主要問題是在金屬的鹽的在染色過程中的沉淀，特別是鉛的沉淀。 NaOH顆粒的使用，以減少沉淀是一種常用的技術。 即使采用最佳的預防措施，析出可能破壞許多小時或工作甚至幾天，臨界半小時染色的過程中。

另一個被廣泛經驗的問題就是網格，可以很容易地破壞影片的支持，甚至部分的反復操作。

因為包括許多步驟的手工操作，在整個染色時間的用戶的存在是必要的。 此外，當只有少量的網格可同時染色時，程序必須經常重復進行。 因此，人工染色大大有助于在EM實驗室的工作負荷。 如果多個序列或長的連續切片的染色將被執行，特別是如果短染色時間被使用的，一致的重現性是困難的，有時甚至是不可能獲得的。

最后通過的危險化學品的反復操作時的污漬和染色的制備過程中的增加的健康風險是人工染色的一個主要缺點。

圖8A                                                          圖 8B

圖9A                                         圖9B                     圖9C

自動化反襯

徠卡EM AC20自動雙對比的超薄切片裝在格柵的傳統手工技藝。 該技術的設計提供了一個解決方案，大多數人工染色的傳統的問題，如沉淀和不相等的染色結果。 此外，通過同時對比高達20格，自動加速實驗室程序和標準化的對比結果。 因此，用EM AC20全自動染色給出了一個廣泛的重視改善的電子顯微鏡實驗室常規通過省去了傳統的染色問題，減少了對健康的危害，并給予技術人員的時間為更有價值的工作。

該儀器采用預包裝的，穩定的乙酸雙氧鈾（UA）的溶液和檸檬酸鉛染色，以盡量減少與危險的化學品，并消除了降水和污染控制和標準化污點制備和裝瓶由于用戶的接觸（參見第2章）。 在Leica EM AC20的心臟是蠕動泵和非接觸式的閥門系統，這意味著該試劑通過只是空氣密封腔管行進。 該泵閥門，管件系統包含兩個獨立的管道設置窗口。 一個允許控制試劑的流和沖洗到爐柵室（圖9b）。 第二引導廢物從所述腔室到特定廢液瓶。

影響因素對比

在染色技術，用在對比質量影響最大的因素是質量和染色溶液的濃度。 旁邊的污漬，所述因素例如定香劑，緩沖劑，沖洗水，脫水，漂洗時間，包埋劑和聚合的程度以及切片厚度的類型影響的對比度也。

一般因素

固定劑

************固定劑增強了對比度。 它可以作為固定劑，以及后染色過程中的對比度增強器通過用乙酸雙氧鈾和鉛citrate.It已經表明，固定時間對由乙酸雙氧鈾的對比得到的對比度的效果相互作用。 長固定用************減少如染色質的對比。 

緩沖器

雙氧鈾與二甲胂酸鹽和磷酸鹽離子可以導致鈾酰鹽沉淀強烈反應。 因此，無沉淀更高的對比度洗滌該樣品固定后廣泛時被獲得。 
磷酸鹽緩沖液可以保持甚至脫水和包埋后的組織，往往會引起小的，本地的，致密物沉積在肌肉和神經組織。 

沖洗水

在CO 2含量的漂洗水的影響通過形成碳酸鉛沉淀的對比度。 新鮮蒸餾水的pH接近中性。 如果蒸餾水中靜置的很長一段時間，CO 2從空氣中溶解。 
此外，低pH <漂洗水中的6.0減小由醋酸雙氧鈾和因此也一般對比度給出的對比。 如果水的pH值低于6.0，加入KOH應為中和加入。 沖洗水也應脫氣或煮沸以防止氣泡其中，如果存在的話，附著在網格中的染色室和禁止染色的形成。 

包埋劑

的Epon和EPON的替代物已經被發現在相似的方式進行對比，因此，不需要特殊handling.Araldite已知，得到固有的背景染色。 因此，較短的對比時間在較低溫度下是recommended.Spurr包埋樹脂通常需要較長的時間的對比。 最好是不染色斯珀爾時提高溫度，因為像的Araldite，樹脂背景本身有一種傾向，占用嵌入試樣的stain.The年齡是很重要的，因為包埋材料的聚合儲存期間繼續進行。 老標本和部分需要更長的醋酸鈾對比時間。 

切片厚度

薄切片顯示對比度比厚的部分，但更高的分辨率下，由于存在對污漬較少的位點被綁定到。 因此，薄的部分需要較長的染色時間比較厚的人。 

聚合級

聚合的不好包埋劑是軟的，難以削減，占用污漬迅速。 因此，建議一個較短的對比時間在較低溫度下進行。 

整塊染色

試樣的嵌入前對比已經成為近年流行的強化無沉淀物形成對比的方法。 
然而，“整塊”染色本身并不提高試件的對比度足夠的大部分研究。 同時與部分郵政染色，醋酸鈾和檸檬酸鉛建議在大多數教科書。