經過反卷積算法已被應用，還原圖像可能包括明顯的文物，如條紋，振鈴，或不連續的細胞骨架染色。 在某些情況下，這些問題都涉及到數據表示，不會與不同的算法或軟件程序包發生。 當加工參數配置不正確，對原始圖像也可能出現偽影。 *后，文物往往不被計算引起的，而是由組織學，光學偏差，或電子噪音。 當試圖診斷的神器之源，*步是與反卷積圖像仔細比較原始圖像。

如果工件是在原始圖像中可見，那么它必須由因素從上游的反褶積引起的。 通過調整原始圖像的對比度和亮度，一些偽像可以顯示，并不明顯時*眼。 如果神器不存在或檢測不到的原始圖像，然后反卷積的某些方面被牽連。 在后一種情況下，它可能是有用的各種算法（例如，逆濾波器對受約束的迭代算法）進行比較反卷積的結果。

點擴散函數的注意事項

點擴散函數（PSF）的質量是一個卷積算法的性能至關重要，應嚴加審查。 嘈雜的，畸變，或不正確縮放的點擴散函數將會對反褶積結果的不成比例的影響。 這是為迭代技術尤其如此，因為該點擴散函數被反復施加到計算中。 在所有情況下，模糊光在原始圖像上的分布和程度，必須對點擴散函數相匹配。 如果不匹配的點擴散函數是利用，那么文物可能導致或恢復的質量可能會下降。

在許多商業反卷積軟件包，用戶可以選擇任何一個理論或實證的點擴散函數的圖像復原。 在一般情況下，結果是，如果一個經驗點擴散函數采用更好，并且還有不優先使用的理論點擴散函數的幾個重要的原因。 首先，盡管存在著良好的理論模型的點擴散函數，它們是不**的模型，并進行了實證的點擴散函數包含在理論模型沒有可用信息。 其次，在商業軟件包提供了理論點擴散函數通常假設**的軸向和旋轉對稱的，這意味著它可能無法正確地適應模糊在原始圖像上的分布。 這個問題是在高分辨率*嚴重（例如，與具有數值孔徑在1.2和1.4范圍內的物鏡），其中，在所述透鏡組件或光學涂層小的制造變化可引起輕微的畸變中的點擴散函數的對稱性。 一個理論點擴散函數不能反映這些鏡頭的具體變化和產量較差反褶積的結果。 此外，一個經驗點擴散函數可有助于選擇合適的物鏡進行反卷積分析。

呈現在圖1是一系列理論上生成的等高線圖的共聚焦點擴散函數是逐步更深的名義焦點位置成水介質。 油浸物鏡的利用率是假設，和點擴散函數的顯著軸向傳播的浸油和水，其與聚焦深度增加之間的不匹配的折射率的效果。 歸屬于在理論上模擬曲線僅這一個可變的點擴散函數的象差的復雜性說明了為什么點擴散函數的實驗測量是準確占可能影響反褶積結果像差的優選手段。 圖1（a）示出了無像差的共焦PSF在匹配指數介質，沒有像差的存在。 點擴散函數的軸向程度明顯增加的焦點位置（通過第1（e）圖1（b））改變為更深入地沿著z軸，點擴展函數被移向物鏡。（本文來源：奧林巴斯顯微鏡文物和畸變的反卷積分析）

像差，很難檢查復雜樣品時，檢測變得非常清楚檢查從單一熒光珠產生的點擴展函數時。 因此，在購買一個昂貴的新的物鏡之前，建議從幾個物鏡點擴散函數來獲取和比較，以幫助選擇系統與*理想的點擴散函數。經驗點擴散函數的另一個好處是，它能夠使顯微鏡來測量成像系統的性能。 也會發生點擴散函數采集過程中的實驗過程中可能發生的許多潛在的問題，如舞臺漂移，燈的閃爍，照相機噪聲，折射率不匹配，和溫度波動，而且更容易辨別。 因此，在實證的點擴散函數畸變建議如何改善顯微鏡拍攝的圖像的質量。

當獲得的經驗點擴散函數，必須小心，以配合出現在原始圖像畸變。 理想的情況下，無論是原始圖像和點擴展函數應該是免費的像差，但是，這并不總是可能的。 如果主要的像差是存在于原始圖像，那么他們應該（如果可能）由像差的點擴散函數匹配。 否則，反卷積圖像可能包含錯誤或恢復不佳。 此外，如果該點擴散函數是喧鬧的，當時的主要噪聲將出現在反卷積圖像。 為了減少噪音和消除輕微的畸變，許多軟件包徑向平均的點擴散函數或平均的幾個熒光珠的圖像來創建一個平滑的點擴散函數。 許多商業軟件產品的另一個特點是，它們會自動插采樣間隔的點擴散函數的相匹配的采樣間隔把原始圖像的。 如果不是這樣，點擴散函數和原始圖像必須在相同的采樣間隔被收購。

當使用一個理論點擴散函數，點擴散函數的參數必須正確設置。 這些參數包括成像模態，數值孔徑，出射光的波長，像素大小和z步長大小，并且可以顯著地影響所得到的點擴散函數的大小和形狀。 在一般情況下，隨波長的增加而減小與數值孔徑的點擴散函數的大小增加而增加。 像素大小和z步驟參數被用于相對于所述原始圖像縮放的點擴散函數。

如果理論點擴散函數的大小和形狀是不恰當的原始圖像，則工件可導致對各種原因。 首先，該算法解釋中的點擴散函數尺寸方面的采樣間隔的圖像。 第二，點擴散函數確定的體積的大小和形狀從模糊的光被重新分配。 如果卷不對應模糊的圖像中的真實分布，然后器物可以推出。 可能會發生這個錯誤，如果有錯誤縮放或像差的點擴散函數。 它也可以導致如果圖像的“真正的點擴展函數”具有未由算法生成的點擴散函數相匹配的像差。

在某些情況下，使用的是理論點擴散函數時，更好的結果，可在點擴散函數是顯然太大獲得的。 一種可能的解釋是，原始圖像的真實點擴散函數是大于預期。 這可能發生，因為折射率的不匹配，從而導致球面像差和改變z軸縮放。 這兩種現象加寬真正的點擴散函數在z方向上，使它更大，從而降低了物鏡的有效數值孔徑。如果這種情況下，懷疑是，研究者應該試圖減去一個小的增量（例如，0.05）的理論點擴散函數的數值孔徑。 在一些軟件包，類似的結果可以通過將點擴散函數的z步長，以比實際的z步驟中獲取的原始圖像利用較小的獲得。

正常情況下，點擴展函數的z步長應始終是相同的原始圖像的z步驟。 此小心確保該點擴散函數的標度是合適的成像條件。 用經驗點擴散函數，但是，有可能獲得更細的z軸分辨率比原始圖像中的點擴散函數。 應該提到，這招只有當該軟件可以插采樣間隔的圖像，并使其對應的點擴散函數。

目前，大多數市售的反卷積軟件包假定點擴散函數是恒定的所有點的對象，被稱為空間不變性的性質。 光學顯微鏡通常滿足這個假設，但其他的問題，如折射率梯度的樣品材料或浸泡的不匹配和安裝介質可以誘發空間變化的點擴散函數，尤其是在厚厚的標本。 目前，所有的商業軟件包假設空間不變性，但在未來（由于迅速增長的計算機處理速度），也可能是可行的，通過圖像變化的點擴散函數。 它也可能成為可能通過采用透射光圖像映射折射率梯度的試樣，并相應調整點擴散函數來校正點擴散函數的空間變化。

球差

球面像差是點擴散函數差的臭名昭著的形式，是*難以對付的。 該工件包括在點擴散函數，它們都增大了的點擴散函數的喇叭形，并降低其亮度的形狀的軸向不對稱性。 在各種形式的光學顯微鏡的一個共同的問題，球面像差是退化的分辨率和信號損耗在兩個共焦和廣角調查的主要原因之一。 檢測球面像差可以通過集中上下貫通的試樣，在離焦的環的上方和下方的明亮的熒光點狀的細節（如示于圖2）觀察的不對稱性來實現。 或者，工件可以在所獲取的圖像堆棧（在XZ或YZ的突起）通過在模糊的光的周圍的熒光結構的喇叭形搜尋在軸向不對稱性檢測。 第三種技術檢測球面像差的有用的是從一種熒光珠安裝類似的光學條件下的試樣根據獲得的點擴展函數的圖像，并且搜索軸不對稱的點擴散函數的喇叭形。

如果在觀察的標本是比較厚的（大于10微米），球面像差可逐漸成像發生在試樣內部更深層次的誘導。 因此，直屬蓋玻片表面貼裝珠可能不能揭示球面像差在這種情況下。 一個建議的補救措施是從靠近試樣中的所希望的圖像平面通過*暴露試樣的熒光珠的溶液用珠獲得的點擴展函數的圖像。 然而，這點擴散函數不應該用于反褶積，因為從組織散射會使點擴散函數喧鬧得多，在大多數情況下。

球面像差是在成像系統中的光學路徑的缺陷所致。 它可以是由于在物鏡的缺陷，但更經常的像差的發生是由于折射率的光學介質直接相鄰的物鏡前透鏡元件的不匹配。 現代的物鏡通常被設計來校正和/或減少的球面像差，只有當他們被用來與蓋玻片玻璃的適當的類型和厚度，以及適當的浸泡和安裝介質。 這些材料的光學特性是至關重要的光通過物鏡（和顯微鏡光學系列的其余部分）的正確聚焦。（本文來源：奧林巴斯顯微鏡文物和畸變的反卷積分析）

在圖2（牛肺動脈血管內皮細胞）呈現的圖像被收購與寬視場熒光成像相似的條件下，除了浸油的折射率的變化的系統。 將原始圖像（*大強度投影），如圖2（a）所示的具有1.514的折射率的浸沒油被獲取，并且是自由可觀的球面像差。 圖2（b）是反卷積后的相同圖像。 類似的細胞，具有較高的折射率（1.524）的油狀物，并表現出顯著球面像差獲取的，如圖2（c）所示。 周圍的細胞周圍的點的衍射環是差的表現。 以下通過反復的約束反褶積（圖2（d）），恢復原始圖像的一個水平行的一個子體積的邊緣引入（以箭頭的右側）。此工件不存在于原始圖像（圖2（c）），并且，因此，不通過成像系統所造成的。

相當普遍的生物學調查，浸泡和安裝介質的折射率不相同，甚至接近。 在這些情況下，可能會發生兩種扭曲：球面像差和z軸距離的縮放比例。 這兩種現象取決于震源深度，所以在不同深度的功能將展示不同量的球面像差和z軸比例文物。 雖然z軸縮放不會影響分辨率或信號強度，但它代表z軸的距離測量的線性縮放由不匹配的介質的折射率之比。 為了校正這種扭曲，Z-距離可以由標量補償系數相乘，有些軟件包提供此功能。 在另一方面，球面像差是難以糾正，因此非常誘人忽視，但是也有少量的注意這個問題可以產生的圖像質量有很大的提高，尤其是在弱光條件下，如在活細胞。

*近，一些研究已針對數位與球差的點擴散函數解卷積校正球面像差。 這需要解卷積軟件不能自動進行預處理的點擴展函數以使其軸向對稱。 如果是這種情況，那么顯微鏡能精確地通過具有在手“家庭”的經驗點擴散函數不同程度的球面像差，并選擇*合適的點擴散函數的匹配在圖像和點擴散函數的像差給成像條件。 這種類型的計算修正的可能恢復丟失的分辨率在一定程度上，但它不會恢復丟失的信號。 因此，為了校正球面像差的*佳機制是通過光學方法預先消除神器。

有很多種由顯微鏡來校正球面像差的光學技術和技巧。 一對標本浸泡在水溶液中*常見的應用是浸油的物鏡，它可以直接進入安裝介質中無蓋玻片。 因為浸漬和安裝介質是相同的，沒有折射率不匹配是可能的。 然而，失真仍然可以發生，因為試樣和沉浸介質之間或者由于試樣本身內的折射率的梯度折射率失配。 另一種方法涉及調節浸沒介質的折射率，以補償所述安裝介質的折射率。 如果試樣被安裝在低折射率比玻璃的介質（例如，甘油或水基介質），則增加了浸沒介質的折射率，減少或消除小程度的球面像差。 用具有1.4數值孔徑的物鏡時，該技術使一個相對無像差的成像條件達約10至15微米的蓋玻片的有限焦點深度和試樣安裝在甘油。 幾個商業供應商現在提供浸沒介質具有規定的折射率，可以混合以任何期望的中間值。

另一種常用的方法是使用一個專門校正物鏡，如高數值孔徑的水浸泡即日起接受報名與蓋下滑標本的物鏡。這些物鏡有一個校正彩色，使補償透鏡元件和試樣之間的折射率的變化。 雖然他們都非常昂貴（目前約10,000美元），水浸的物鏡可以提供成像深度大于15微米成厚片，當以消除球面像差的*方法。 對這些物鏡的修正衣領不應該混淆與較便宜的暗場的物鏡找到了可變光圈校正衣領。

數字圖像采樣間隔

適當的采樣間隔在x，y和z方向上是不錯的解卷積結果重要。 這是標準的做法，以獲取樣本可分辨的空間頻率的兩倍，這符合奈奎斯特采樣定理（每個元素解析兩個樣本都需要精確的檢測信號）。 然而，奈奎斯特采樣頻率是真的只是需要一個離散采樣機制取得的實際信號的合理近似*小。 更高的采樣頻率產生***的修復，應用三維算法時尤其如此。 與此相反，二維去模糊算法*有效地工作，當取樣率是較低的在z方向上（當光學部之間的間距等于或大于分辨的元素）。

在熒光顯微鏡中，可分辨的元素通常使用的瑞利準則來定義。 例如，與染料FITC（在520納米的發射峰），1.4數值孔徑的油浸物鏡，并用1.51的折射率（*匹配的光學玻璃）的安裝/浸沒介質，所述解析單元尺寸為227納米的（根據瑞利準則）的xy平面和801納米的在z方向上。 樣品在這些條件下的奈奎斯特頻率，采樣間隔應為這個值的一半，或在xy平面和0.4微米的在z方向上約0.114微米。 提供在圖像恢復的*佳效果，取樣在一個較小的間隔建議，也許0.07微米的在xy平面和0.2微米的在z方向上，在相同的條件下。

應當指出，這些準則是*佳設置，并應通過考慮所研究的特定制劑的平衡。 作為一個例子，熒光信號可以是如此之低（常出現在活細胞的實驗）的CCD的像素的像素合并這是必需的，或者可以如此之快，以至于沒有足夠的時間，以在z方向上精細樣品發生的事件。 在這種情況下，*理想的采樣間隔是必需的。 幸運的是，修復算法仍然可以工作相當會在這些條件下，雖然在正則有些變化可能是必要的，一些算法。

振鈴和邊緣文物

振鈴是在去模糊或反演技術的應用主要是遇到了一個神器，但它也可能發生與迭代法。 該工件具有深色和淺色的漣漪周圍的圖像的明亮的外觀特征，如圖3所示，并且可以既在z方向上和在xy平面內發生。 當在z方向上可視化，振鈴出現在更深的z截面的陰影，概述熒光結構。

振鈴的源通常是轉化的不連續信號進入或離開傅立葉空間。 一些相關的問題可以產生信號的不連續性，因此有助于振鈴。 不連續性可能發生在圖像的邊緣或圖像的子體積的（圖2）或者甚至在明亮的特征的邊緣（圖3）。 不連續性的另一來源是將原始圖像或點擴散函數，在嘈雜的圖像或點擴散函數和點擴散函數的形狀，是不恰當的圖像的空間采樣不足。

在圖3所示的每個圖像是從圖像的三維堆疊的單個代表性的光學部分，并示出了從固定部金字塔細胞樹突。 的原始圖象被顯示在圖3（a）所示，而圖3（b）是同一圖象場以下迭代解卷積。 在反卷積圖像，顯著振鈴發生（約熒光樹枝狀暗輪廓），*有可能的，因為球面像差中的原始圖像，它是不是在點擴散函數匹配。 在相同的圖像，噪聲放大顯示為背景的斑點。

為了避免振鈴*好的辦法是確保傅立葉適當開窗變換。 盡管一些商業軟件包都沒有解決這個問題，它正變得越來越常見于高端的算法實現。 振鈴也可避免使用更精細的采樣間隔中的圖像或點擴散函數，通過平滑的圖像或點擴散函數，以在與這些圖像的點擴散函數精心匹配的像差，或通過調整該點的傳播函數的參數。

振鈴的圖像的邊緣可以通過簡單地去除邊緣被抑制。 許多算法消除圍繞整個圖像8至10像素或飛機保護帶 。該操作需要空白空間的上方和下方的熒光結構的圖像中要保留。 空白空間是不可取的，因為從上面和下面的對象模糊的光可被重新分配，并有助于該信號為對象。 然而，空白空間可以人工創建的，而不保真度的損失，通過將內插平面到圖像堆棧的頂部和底部。 在計算機的存儲器和處理時間所得的成本可以通過在傅立葉空間中進行的內插被*小化。

振鈴子卷的邊緣是一個類似的問題（見圖2）。 通常情況下，亞體重疊量可提高到取出神器。 或者，如果足夠的隨機存取存儲器（RAM）被安裝，則整個圖像可以被處理為一個單一的體積，以避免偽像。

噪聲放大和過度平滑

如前面所討論的，噪聲放大是由去模糊和反演算法一個工件。 神器也會發生與迭代算法的重復卷積運算引入的高頻噪聲。 噪聲圖像反褶積表現為圖像，往往是在每一個平面不變的，是特別引人注目的背景區域的顯著斑點。 它通常可以通過應用平滑濾波器或一個正規化（ 粗糙度 ）濾波器抑制。 在過度的噪音是在一個反褶積圖像中觀察到的情況下，然后朝一個補救措施的*步是確保點擴散函數為噪音盡可能免費。 接著，檢查算法過濾器和嘗試優化他們的可調參數，使圖像功能比分辨率限制的維持，而較小的變化被抑制。 不要增加平滑太多，因為過度的平滑特性會降低圖像的分辨率和對比度。

消失和爆炸特性

也許是反褶積的*討厭的文物是非常暗淡的功能明顯損失或非常明亮的特點炸毀 （開花或對比度爆炸）。 這些工件不同于過多引起的平滑的，因為它們影響到特定的功能（圖4），相對于該圖像作為一個整體。 在這種情況下，作出嘗試來比較不同的算法對工件的外觀（如逆濾波器對迭代算法，或古典與統計算法）的影響。如果神器只出現一個單一的算法，那么原因可能是不穩定的算法或算法對特定樣品類型的特定效果。 在其中的影響發生與幾種算法的情況下，則有多種可能的來源。 當圖像小，昏暗的特征正在消失，其原因往往是非負性和平滑濾波器的組合。 這是可能的，如果有過多的噪音圖像或點擴散函數發生，或者如果情況有利于振鈴。 噪聲和振鈴可誘導的負像素值，以使非負性約束被調用和功能被分散。 如果發生這種情況，平滑濾波器可以移除或平滑許多剩余的片段，產生該特征的消失。 工件的嚴重性可以補償（或者它可以完全被消除），通過減少圖像中的噪聲和點擴散函數（具有更長的曝光時間，或通過平均），通過消除點擴散函數的不匹配，并通過適當調節平滑篩選。

圖4示出相似于一個先前顯示（圖3）的光學部分的放大的細節。 三個擴印被從原始圖像拍攝之前，反卷積（圖4（a），上游），以及反卷積得到越來越多的迭代之后（250和300的迭代;圖4（b）和4（c））。 一個小的特征，由箭頭表示，消失的迭代解卷積的結果。 可避免的點擴散函數的正確應用這種類型的神器。

當明亮的特點是擴大一個反褶積的圖像，則源可能是像素的飽和度。 包含一個顯著一些明亮的特點RAW圖像都會有這樣的亮度還原過程中進一步擴展。 然而，在非常明亮的特性，反卷積算法可導致像素值*過在給定的位深度的*高值表示的。 實際上，這些像素將飽和 ，將被分配的*大值。 那么該功能將變得非常明亮，會出現扁平化，并在規模可能擴大。 神器可避免利用攝像頭和軟件，將允許更大的位深度和一種算法，在內部存儲數據為浮點數。 使用這些技術擴展計算機存儲器的要求，但可防止這樣的偽影的發生。

標本依賴文物

科學文獻的成熟與一些標本類型，但不與他人觀察到反褶積文物的報道。 特別是，一些研究者已經報道，絲狀結構分散的一類卷積算法，但不與另一種。 如果一個結構變化觀察，那么它始終是*好比較反褶積和原始圖像。 如果仔細觀察發現，反褶積后的結構特征明顯不會出現在原始圖像，然后點擴散函數的參數進行檢查，以確定其正確的設置，點擴散函數也應審查的噪音。 如果問題仍然存在，那么整個算法是嫌疑人，不同的算法對神器的外觀效果應該比較。 此程序將驗證由一個給定的算法的特定樣品是否恢復到令人滿意的程度。

當一個明顯的神器是可見的兩個反褶積和RAW圖像，然后試樣制備或光學像差的某些方面被牽連。 特別是，免疫熒光染色往往是不連續的沿細胞骨架絲（肌動蛋白絲，微管和中間絲）。 一些消息來源可以有助于這一問題。 之一是細胞骨架相關蛋白可能掩蓋細胞骨架細絲，使抗體可訪問性是沿燈絲變量。 另一個來源是在免疫細胞化學使用的固定劑，它往往不如實地保留絲狀結構。 例如，微管可在甲醛或甲醇固定片段。 一個更忠實的固定劑如戊二醛可以采用，但在抗原性為代價的。 *佳的固定方法是在各種文獻來源和教科書中描述。

標本相關文物的一個常見來源源于折射率梯度的標本本身。 在試樣這些原因透鏡效應光之前到達物鏡，因此，可能會扭曲的形象。 一些標本（例如，胚胎和厚組織）有卵黃顆粒或其他細胞器，其折射率顯著不同于周圍的細胞質。 此外，可能存在折射率梯度所造成的安裝介質的均相混合的裝試樣。 這件神器是特別容易，如果試樣安裝在其以前沒有浸泡的媒介。 計算方法為糾正這種異質性可能提供在未來，但它始終是一個很好的做法徹底浸泡標本中被很好地匹配到試樣本身的折射率的安裝介質，以盡量減少這些文物。 作為補充措施，這是明智的調整浸入介質的折射率（如果可能），以補償該安裝介質。

水平線和垂直線

大概解卷積顯微術的*常見的偽影是在x，y和z軸的水平線和垂直線。 在許多情況下，這些線路可以在當它被仔細研究的原始圖像被觀察到的，這表明它們不是反卷積操作的結果，而是由算法被增強。 線或條帶也可能來自于子卷，振鈴形式之間的界限邊緣的文物。 在任何情況下，這樣的工件都難以誤認為是生物結構，可以很容易除去。

在xy平面水平或垂直的線條往往是由于CCD傳感器用來記錄影像柱缺陷 。 如果在芯片的讀出寄存器中的一個像素的缺陷，或者如果傳遞到該像素是低效率的，那么結果可能顯示為垂直于所讀取的寄存器的一行。 這條線，然后由卷積運算增強。 如這個問題通常可以用一臺調遣的操作來校正，也稱為陰影或背景校正，并且被包括在大多數反卷積軟件包。

在XZ或YZ的視圖（稱為Z-線 ）觀察到的垂直線是由于變化的各個像素的響應特性。 每個像素具有一個稍微不同的增益和其鄰國的偏移。 在極端情況下，也有不好的像素 ，其光子響應從他們的鄰居顯著偏離。 通常，在相同的像素系統從其鄰居偏離整個堆棧的圖像，剩下的z線。 這個問題可以通過平場作業或由搜索出這些匪徒，并將其與自己的近鄰均值代替專門的壞像素例程進行修正。

與此相反，在XZ或YZ意見水平線代表在圖像堆棧是比他們的鄰居均勻明亮的整個平面。 這個問題是由于在該照明系統的波動。 在數據收集過程中的弧光燈的功率輸出偏離的情況，那么這種變化將被記錄在平面之間的熒光強度的系統性差異。 此外，電弧在燈可以漫步在電極的表面上，誘導時間依賴性的空間不均勻性在試樣的照明。 這些活動將通過反褶積會加重，但可在原始圖像進行觀察。 這兩個問題通常可以通過更換弧光燈被*小化。

如果燈的波動仍然是，即使有新的弧光燈，然后直接測量弧光燈功率波動的結合的總的像素強度的平面由平面可被用來校正應用到原始圖像中的多項式擬合的一個問題。 這種類型的校正的某種形式被包括在大多數市售的反卷積包。 第二個問題，由于電弧徘徊變化的照明圖案，難以校正由圖像處理，但是可以通過安裝弧光燈和顯微鏡垂直照明器之間的光纖加擾器來消除。