徠卡顯微鏡，簡介冷凍置換
冷凍取代是脫水的過程中，在溫度足夠低的執行，以避免冰晶的形成和規避后常溫脫水觀察到有害的作用。 在冷凍取代的“凍結”的水是由一種有機溶劑，它通常還含有化學固定劑溶解。細胞成分（冷凍固定）和樹脂包埋的冷凍替代鏈接的即時物理固定。 一旦置換完成后，樣品被逐步回暖，并進一步作為常規方法制備的樣品進行處理。 成功的低溫定影接著FS表示微細結構的優異保存相比，化學固定技術在有機溶劑中和水合層周圍的生物分子的變化的大分子聚合可以在非常低的溫度下發生，即使，但它是合理的假設，FS在溫度低于特定閾值保留水化殼
該技術還提供了檢查厚（200-300納米的部分）的樣本由ET，使得相對大的細胞量可以在3D進行研究的可能性。 這種方法是非常有益的不同細胞器和隨機發生的事件之間的復雜關系的理解。
圖 1：酵母（釀酒酵母）。 禮貌面包車Donselaar EG，Humbel獸王，烏得勒支大學，荷蘭;插槽JW，大學醫療中心，烏得勒支，荷蘭。
高壓電子顯微鏡凍結，凍結取代擬南芥根尖細胞
禮貌：德Rycke?
協議HPF - AFS的形態分析
擬南芥根（突變PIN1pro：PIN1-GFP; bex5-1）切下，浸漬于20％（重量/體積）BSA和在高壓冷凍機（Leica EM PACT）立即冷凍。
冷凍置換進行中含1％雙蒸2 O，1％的OsO 4和0.5％戊二醛在4天期限如下干丙酮使用Leica EM AFS2：
-90℃下放置24小時，
每小時增加2℃，15小時，
-60℃下放置24小時，
每小時增加2℃，15小時，和
-30℃下放置24小時。
然后將樣品洗滌3次，在純丙酮在-30℃，0℃，并緩慢升溫至4℃，滲透逐步3天以上，在4℃中的Spurr的樹脂和嵌入在膠囊中。 在70℃下進行16小時的聚合反應。
超薄切片用超薄切片機（Leica EM UC6）在20℃下制成和后染色中的Leica EM AC20進行40分鐘的醋酸雙氧鈾在20°C和檸檬酸鉛10分鐘 網格被看作用JEM 1010透射電子顯微鏡（ 日本電子 ，東京，日本）使用成像板技術從80千伏運行Ditabis （德國Pforzheim）。
高壓免疫電鏡冷凍和冷凍取代的小鼠心臟
禮貌：德Rycke?
協議HPF - AFS小鼠心臟IEM
從野生型（WT）和αT-連環KO（KO）小鼠的小鼠心臟組織中切下，浸漬于20％（重量/體積）BSA和在高壓冷凍機（Leica EM PACT）立即冷凍。 冷凍置換進行中含有2％雙蒸2 O和0.1％戊二醛在4天期限如下干丙酮使用Leica EM AFS：
-90℃下放置24小時，
每小時增加2℃，15小時，
-60℃下放置24小時，
每小時增加2℃，15小時，和
-30℃下放置24小時。
然后將樣品洗滌3次，在純丙酮在-30℃，0℃，并緩慢升溫至4℃，滲透逐步3天以上，在4℃在LR-White和嵌入在膠囊中。 用紫外燈超過6天，開始于20°C和37°C。在結束徠卡EM AFS進行聚合
超薄切片用超薄切片機（Leica EM UC6）在20℃下制成和后染色中的Leica EM AC20進行40分鐘的醋酸雙氧鈾在20°C和檸檬酸鉛10分鐘
網格被看作用JEM 1010透射電子顯微鏡（ 日本電子 ，東京，日本）使用成像板技術從80千伏運行Ditabis （德國Pforzheim）。
免疫標記和標簽進行量化如前所述進行
以下主要抗體用于免疫EM：
Cx43蛋白多克隆兔（1:50; Sigma）和
結蛋白多克隆兔（1:50; Abcam公司）。
在Li等人的文章還有其他的圖像顯示，為鞭策'的樹脂和HM20（與徠卡HPM010）處理（與徠卡EM PACT與leica EM AFS），但是這是沒有問題的，我們的協議在這里說明一下的是為顯示圖像。
圖3：Cx43蛋白銀擴增從αT-catenin的KO小鼠心臟的閏盤（ICD）的代表縫隙連接單免疫標記。
圖4：Cx43蛋白銀擴增從野生型小鼠心臟的閏盤（ICD）的代表縫隙連接單免疫標記。
圖 5：結蛋白在從αT-catenin的KO小鼠心臟一橋粒單免疫標記。
圖6：結蛋白在從αT-catenin的KO小鼠心臟一橋粒單免疫標記。
Hep-2細胞感染了肺炎衣原體
禮貌：Kaech一
協議
Hep-2細胞感染了肺炎衣原體的培養在碳包覆6毫米藍寶石光盤。 細胞呈高壓使用6毫米CLEM中板與下面的設置凍結在徠卡EM HPM100：藍寶石光盤細胞，墊片200微米，裸藍寶石圓盤，2墊片200微米。 乙醇被用作同步液在室溫下冷卻之前的壓力傳遞。 冷凍后，將藍寶石圓片從中間板的無水丙酮除去在-90℃，并立即轉移到含有2％的OsO 4的無水丙酮2ml的Eppendorf管中，預冷至-90℃的徠卡EM AFS2凍結 - 替換單元。
樣品被取代
在-90°C 8 H，
在-60℃下8小時，
在-30℃下8小時，并
在0℃下1小時
與周期性溫度變化30℃/ h的梯度。 然后將樣品洗滌兩次，用無水丙酮在4℃下，浸漬于33％的Epon /愛牢達在無水丙酮中，在4℃過夜，然后66％的Epon /愛牢達在無水丙酮中，在4℃下進行6小時，最后在100％的Epon /愛牢達在室溫下攪拌2聚合之前小時60℃下在1.5ml的Eppendorf管中至少24小時。 切片進行染色后，用醋酸鈾和檸檬酸鉛。
注意：使用乙醇作為在高壓冷凍同步流體是沒有必要的藍寶石圓盤細胞培養單層。 一個簡化的夾層結構可用于通過將藍寶石圓盤中的CLEM中間板與細胞面朝上覆蓋有鋁試樣載體浸漬在1 - 十六碳烯與100μm的空腔面向所述細胞以提供類似的結果。
圖。 7：Hep-2細胞感染了肺炎衣原體，概述的薄截面。 N，核，怒族，核仁;在，包容。 比例尺為5μm。
圖。 8：高倍列入細胞在圖1所示。 C，肺炎衣原體細胞，G，糖原顆粒;去，高爾基體，M，線粒體;山，微管，R，核糖體，V，囊泡。 比例尺為500nm。
圖。 9：Hep-2細胞感染了肺炎衣原體的薄截面。 概述。 N，核，怒族，核仁，NP，Nucleopores，Z，閉鎖小帶adhaerens。 比例尺為2μm。
圖。 10：Hep-2細胞感染了肺炎衣原體的薄截面。 更高的放大倍率在圖3中選擇區域。 A，肌動蛋白細絲; MB，Mulitvesicular體;萬噸，微管，N，核，NP，Nucleopores，R，核糖體，Z，閉鎖小帶adhaerens。 比例尺為1μm。
圖。 11：Hep-2細胞感染了肺炎衣原體的薄截面。 更高的放大倍率在圖4中選擇區域。 CP，網格蛋白包被坑，山，微管，R，核糖體，Z，閉鎖小帶adhaerens。 比例尺為200nm。
更多應用程序映像
禮貌：面包車Donselaar EG，Humbel獸王，烏得勒支大學，荷蘭;插槽JW，大學醫療中心，烏得勒支，荷蘭
圖。 12-14：鼠標軟骨
圖。 15：肝HepG2細胞
圖。 16：酵母