全內反射熒光（TIRF）是一種特殊的技術，在20世紀80年代初在安阿伯市密歇根大學的丹尼爾·阿克塞爾羅德在熒光顯微鏡。全內反射熒光顯微鏡提供的圖像具有出色的高軸向分辨率低于100納米。這允許與膜相關的過程的觀察。

全內反射熒光顯微鏡

它允許靠近的玻璃/水（或玻璃/試樣）接口的熒光分子成像。這是通過采用的漸逝波通過交付的弧光燈，發光二極管（LED）或激光的光激發的熒光基團，而不是直接照明。如果入射的光被全反射的兩個具有不同折射率的透明介質的界面處發生的漸逝場。在生物應用中的入射光通常是激光和接口的玻璃蓋玻片，蓋玻片和貼壁細胞的膜之間的水溶液。

隨著能量的漸逝場到界面的距離呈指數下降，只有在一定的接近蓋玻片的熒光基團被激發。這允許創建的圖像具有出色的信號噪聲比，其余的細胞的熒光團幾乎興奮。此外，全內反射熒光顯微鏡提供的極高的軸向分辨率低于100納米的圖像。這使得觀察膜相關的過程，如細胞粘附，激素結合，分子運輸和胞吐（如神經遞質的釋放和吸收）和內吞過程。

圖 1：TIRF顯微鏡的原理

全內反射和漸逝場

每當光遇到兩個具有不同折射率的透明介質的接口，這將是部分衍射和部分地反射。的入射角一定的角度，即所謂的臨界角，將被完全反射的光，這種現象被稱為發生全內反射。如果光從更高的折射率（n）的（如玻璃皿中，n = 1.52），在培養基中具有較低的折射率（例如，水性介質中，n = 1.33）中的培養基中，才能觀察到全內反射。的入射光，在發生全內反射的臨界角（Θ ?），可以由斯涅耳定律：

n1和n2是試樣的折射率和蓋玻片。

在發生全內反射，一部分的入射光的能量將被轉換成一個電磁場，并通過接口形成的界面處的漸逝波。新興的倏逝波具有相同的頻率為入射光和其振幅呈指數衰減的穿透深度。因此，內的倏逝波的激發的熒光團與光子的相互作用，但與電磁場的相互作用。在此字段中的穿透深度范圍通常在60?100納米，但可以去到200nm。它依賴于光的入射角，波長和兩種介質的折射率（例如玻璃蓋玻片和試樣）的角度。增加導致減少的穿透深度和較高的波長的入射光的光的入射的角度，導致增加的穿透深度。背后的接口的介質的折射率（例如，試樣）的穿透深度的影響也有更高的折射率增加的倏逝波的穿透深度。還應當指出，在TIRF顯微鏡高功率的激光，這是比通常采用的激光共聚焦系統中，是用來形成有足夠能量的倏逝波強。

物鏡的全內反射熒光顯微鏡

在光學實現全內反射的方法有兩種：一種是基于棱鏡和其他基于物鏡。基于棱鏡的全內反射熒光顯微鏡，棱鏡連接到蓋玻片的表面，該表面定向聚焦光束或激光朝向的蓋玻片/介質界面。隨著棱鏡的幫助下，穿透光的角度被調整到臨界角。

現代全內反射熒光顯微鏡系統通常是基于物鏡的。的光，通常激光的光被定向到的標本，也收集所發射的熒光通過物鏡。它是強制性的全內反射熒光顯微鏡的物鏡具有一個非常高的數值孔徑（NA）（> 1.45 NA），它允許的入射角大于臨界角的。物鏡的數值孔徑（NA）越高，未能穿透深度越低的漸逝場的光的入射的角度，可以更加平坦。的棱鏡型方法相比，物鏡的方法是更方便的使用試樣以及訪問，能夠容易地改變激光光的入射的角度。通過放置在激光光斑的物鏡的后焦面的不同區域中，用戶可以選擇的激光的入射的角度，并因此而改變的倏逝波的穿透深度。在基于棱鏡的全內反射熒光顯微鏡系統的棱鏡強烈限制了訪問的試樣，難以例如變介質，添加藥物或進行生理測量。

此外，對應的激光，并使用不同的角度入射在棱鏡系統要復雜得多。此外，激光TIRF系統基于棱鏡中出現的安全問題克服物鏡為基礎的系統。棱鏡為基礎的系統中，同時激光更多或更少的公開引導到棱鏡物鏡為基礎的系統中，激光被直接耦合到顯微鏡本身和退出的物鏡在一個非常定義的方式。

全內反射在生物設置

正如上文所述，全內反射熒光顯微鏡的物鏡具有高數值孔徑（> 1.45 NA），這只能通過使用浸油或其他特殊的液浸介質實現。在典型的生物設置，用于生產的瞬逝波的激光的光，有通過的物鏡，液浸介質中和要在蓋玻片/水（例如，水林格的溶液，PBS或其他成像緩沖液）界面反射的蓋玻片。為了避免反射和偏轉的影響，浸沒介質的折射率盡可能接近的蓋玻片（通常為N = 1.52）。對于標準的浸泡油的折射率為n = 1.515 - 1.518在20°C 當然，浸沒介質的折射率是溫度依賴的。盡可能多的實驗，特別是在活細胞成像，在37℃下進行，由溫度引起的變化的折射率的液浸介質可能發生。要糾正這些變化，很多都配備了全內反射熒光顯微鏡物鏡校正領。

圖 2：廣角的的布雷斯特癌腫瘤細胞表達GFP標記的細胞粘附分子在細胞膜上表達的CD44的熒光圖像。

圖 3：同樣的細胞在TIRF成像。禮貌：瑪麗亞·蒙托亞博士，CNIO，西班牙國家癌癥中心，馬德里，西班牙

在一個生物的設置中，會發生全反射的接口，在該接口通常是玻璃蓋玻片之間，其中n = 1.52在蓋玻片和細胞組（n = 1.33）之間的小的薄膜的水性介質中。漸逝場，然后通過該水溶液膜，直徑為約7.5 nm和轉移到細胞質的細胞下降為零，在一定的穿透深度取決于激光光的入射的角度的質膜。在一些景點細胞直接堅持蓋玻片和蓋玻片的細胞（例如，細胞粘著斑）之間沒有水溶液中可以找到。在這種情況下，蓋玻片和細胞之間的界面全內反射的地方。細胞有不同的折射率（約每組1.38）比水溶液，這些斑點，可能是不可見的，當系統設置的蓋玻片/水溶液界面。根據斯涅耳定律，發生全反射的臨界角取決于介質的折射率，因此的蓋玻片/細胞界面的蓋玻片/水溶液的接口不一樣的。此問題是可以克服的，通過改變激光光的入射的角度。

漸逝場的性質，因為它是在呈指數下降，只在約60-100納米的范圍內（根據設定）的蓋玻片/水溶液界面（或細胞本身）的熒光團被激發。這提供了一個軸向分辨率通常為60-100納米（z平面），使觀察，它們位于或關閉到質膜不被淹沒由位于細胞的其余部分中的熒光基團發出的熒光的熒光基團。被激發的熒光團僅在一個“切片”的細胞漸逝場的事實，導致具有很好的信號 - 噪聲比，幾乎沒有任何背景熒光外的聚焦平面制作圖像。

圖 4：廣角圖像的微管蛋白表達CFP

圖 5：微管蛋白CFP TIRF圖像。禮貌：德國馬爾堡大學·雅各教授，的臨床細胞生物學和細胞病理學系，馬爾堡