迄今發現的熒光蛋白及衍生工具的廣泛用途相當廣泛，并已成功地應用在幾乎每一個生物學科從微生物系統生理學。這些獨特的探頭已經證明是非常有用的記者在培養細胞和整個動物的基因表達研究。熒光蛋白在活細胞中，最常用的跟蹤本地化和動態的蛋白質，細胞器，和其他細胞區室，以及細胞內蛋白質運輸示蹤劑。很容易地完成了多種技術，其中包括寬視場，共聚焦和多光子顯微鏡，熒光蛋白的定量成像曝光細胞結構和功能的復雜性，提供了一個獨特的窗口。

復雜的熒光蛋白的光譜和物理性能影響任何定量測量的準確性和效用。許多這些性質，如摩爾消光系數，量子產率，光漂白率，光譜公司的pH值的依賴，可以很容易地用純化的蛋白在體外測量。然而，其他重要的和實驗的關鍵特性，包括發色團的形成（成熟）和蛋白質在體內的降解率的時間過程，更難以確定。對于典型的實驗中，最亮，最穩定的單體熒光蛋白衍生物應選擇，以減少施加復雜背景，在要求較低的應用中光漂白校正的必要性。

在選擇成像實驗中，水母和珊瑚市售的增強型變種，以及它們的衍生物的熒光蛋白載體，應當認真考慮。這些是與青色（ECFP），綠色（EGFP），和黃色（EYFP）光譜區域，現在已經被引入的新的單體的紅色發光熒光蛋白的熒光公司提供。如圖1中所示，獲得的圖像可以選擇使用各種市售熒光蛋白融合載體幾個不同的亞細胞位置。圖1中所示的探針的熒光發射光譜覆蓋的帶寬的幾乎180納米，具有極大值，范圍從440至618納米。這些探針是最亮，最穩定的熒光蛋白的變體，并允許成像照明光漂白（下面討論）和光毒性的問題，如在低光照水平，最大限度地減少。許多熒光蛋白變體（包括EGFP，ECFP和EYFP）可以在足夠高的濃度，可以干擾膜結構的工件，或導致不正確的假設，進行定量先進的熒光共振能量轉移技術，如形成二聚體（FRET） 。

另外的本征亮度的熒光蛋白的基因工程中的表達水平是產生顯著明亮的細胞內信號從融合構建另一個要考慮的因素。使用具有強啟動子的載體，以提高轉錄水平和適當的密碼子，以優化翻譯的應用是必不可少的，用于提高融合蛋白的表達水平，從而提高整體的信號電平。當細胞的自體熒光，使得它難以區分背景熒光的熒光融合蛋白排放時，這一點尤為重要。

多種技術可以應用到一種熒光蛋白融合產物的細胞中的表達水平和亮度增強。此外，丁酸鈉（大約1至5毫摩爾），向培養基中，將增加整體在穩定的細胞系中表達的融合蛋白的基因的表達水平。此外，瞬時轉染細胞的使用是有吸引力的選擇，因為他們經常顯示穩定地轉染的細胞相比，表達水平高得多。應該行使一定程度的謹慎，然而，瞬時轉染由于可能過度表達的文物，包括蛋白質聚集或飽和度蛋白靶向機械，導致不適當的本地化。最后，增加串聯熒光蛋白序列的數目（雙鍵或三）在克隆載體是一種替代方法，用于提高融合蛋白的亮度水平。

臨界熒光蛋白特性

大多數的市售熒光蛋白載體具有改進的性能，由于優化的密碼子使用在哺乳動物細胞中的翻譯和位點定向誘變在較高的溫度下，以提高效率的發色團成熟。對于要求更高的成像應用中，熒光蛋白的表達或物鏡豐度低，在探針的內在屬性將可能是一個限制因素。因此，有必要充分了解熒光蛋白的固有特性，并運用必要的控制，以最大限度地減少成像探針在活細胞實驗過程中可能出現的文物。

光子引起的發色基團破壞，這種現象稱為漂白，熒光蛋白通常是減少的速度和幅度相比，傳統的合成熒光，在類似的條件下，如熒光素和若丹明。這種漂白的阻力被認為是排列緊密周圍的β -蛋白質結構產生熒光蛋白生色團的保護。無論如何，它仍然是重要的，嚴格執行漂白定量成像實驗的控制措施。

率的光漂白熒光蛋白可確定獲取隔時圖像的一系列標記的對照細胞，然后通過定量測量，發射強度，它的表現通常是一個指數衰減逐漸喪失。光漂白的熒光損耗曲線（圖2中所示），然后，可以采用修正的成像實驗。雖然不是一般意義上顯著的問題，如果光漂白成為限制因素成像時的活細胞，抗淬滅劑如抗壞血酸，Trolox的，或Oxyrase（氧和自由基清除劑）可加入到培養基中。

漂白雖然往往是在熒光顯微鏡中的最終的限制因素，許多熒光蛋白衍生物的光漂白率是比較慢的（參見圖2）。另一個限制因素是熒光基團的飽和度，這不會發生在寬視場顯微術，但可以是一個顯著的問題，用激光掃描共聚焦激發強度足夠高，以達到飽和，有時工具。熒光飽和發生時，所有可用的分子都在不斷增加激發光處于興奮狀態，所以不會產生相應增加熒光。在這種情況下，這是非常困難，校準由于非線性，一個問題，即只能通過降低激光輸入功率校正的熒光信號。

細胞內的環境條件，特別是pH值和高的局部濃度，其它一價和二價陽離子，可以改變熒光蛋白衍生物的亮度電平。例如，野生型綠色熒光蛋白（wtGFP）顯示相對亮度均勻pH值為5至pH10，而增強型綠色和黃色熒光蛋白均在酸性pH值水平的驟冷，定位于細胞器（溶酶體）或降低其有效性亞細胞具有低pH值的內飾。其他衍生工具，如ECFP和DsRedFP的是不太敏感的低pH值。然而，許多熒光蛋白融合的產品將被定位在生理pH條件下，這應該不會嚴重影響熒光強度的區域附近的。

固有熒光蛋白，可能會顯著地改變定量成像（但不能準確地在體外測定），發色團的折疊動力學，或導通時間之間的其他物理參數可以有最嚴重的后果。Aequorea victoria的水母（和大多數礁珊瑚）熒光蛋白的衍生物需要的氧化生色團的形成，但氧氣不容易穿透致密的蛋白結構，周圍的三肽熒光。因此，一個相當大的延遲（通常超過幾個小時）之間可能出現的蛋白表達和熒光的外觀。不幸的是，它不是經常容易區分，由于熒光蛋白表達（理想的測量），由于緩慢的發色基團形成（一個工件）之間的延遲。相反的過程，成熟的熒光蛋白在體內降解，也很難監測，但壓倒性的證據表明，許多這些探頭都非常穩定。

顯微鏡參數

廣角，共聚焦和多光子熒光顯微鏡，無論是在直立或倒置配置的，是觀察熒光蛋白在活細胞和組織的理想工具。所需的照明源的范圍從含汞和氙弧放電燈的寬視場，在共聚焦和鎖模脈沖激光多光子顯微鏡（見表1）的氣體和半導體連續波激光器。綠色熒光蛋白及其變種很容易的汞燈或氬離子或氪氬氣體激光器發出的488納米線與明亮的藍色光譜線成像。此外，一臺主機的新的固態激光器的生產線的許多部分，包括在可見光譜的紫光和藍光區域，將被引入。熒光蛋白變體，具有轉移到藍色，紅色，和近紅外波長的光譜通常以更高的效率，使用氙燈或金屬鹵化物燈，以及激光發射線緊密匹配的激發最大值成像的。無論光源，成像熒光蛋白的主要問題是，提供足夠的激勵光，以合理的信號電平。

除了物鏡，下面討論的，熒光蛋白成像的兩個最重要的組成部分是發射濾波器和檢測器。在寬視場顯微鏡中，激發濾光器，二色鏡，和發射濾光器組合成一個光學塊的帶寬被用于激發所述光源由激發光濾光片。例如，汞燈時，需要具有高傳輸圖像的綠色熒光蛋白在450和490納米之間的激發帶通濾波器。更短的波長帶為青綠色和藍色的變體是必要的，而更長的波長帶，用于黃色，橙色和紅色的衍生物。激光線的帶寬只有幾納米的大小，因此，通常不需要使用干涉濾光片的波長選擇。二色鏡切波長應該清楚地分開前有效地反射和發射后者的激發和發射光譜。有很少的保證金的錯誤選擇合適的雙色鏡。另一方面，發射波長的濾光片，可以進行微調，通過從20變到幾百納米的帶寬，這取決于實驗要求。這些過濾器是最靈活的，在確定傳遞到檢測器的熒光發射強度的水平。編目表1中建議的過濾器組合的熒光蛋白的定量成像的列表。這些過濾器的建議，其中包括僅帶通的排放過濾器（實際上，忽略長通濾光片的建議），應被視為僅僅作為一個起點，設計實驗。

一些流行的綠色熒光蛋白的過濾器集的性能的影響，可以判斷圖像進行比較，從相同的視場捕獲的單個濾波器的組合，如在圖3中示出。標本是貼壁培養的胚胎大鼠胸主動脈與一個向量，包含一個紅移的（增強）綠色熒光蛋白的變種，EGFP人類細胞質β -肌動蛋白結合的基因融合蛋白轉染的成肌細胞。融合蛋白的表達，表現出其納入日益增長的微絲，使可視化的亞細胞結構，適當的過濾器組合（見圖3）用熒光顯微鏡。胸主動脈成肌細胞也沾上Mitotracker有：紅CMXRos（線粒體紅色熒光）和Hoechst 33258（細胞核中的DNA;藍色熒光）。請注意信號的情況下，與活塞從藍色和紅色的熒光基團，賦予帶通濾波器（圖3（a）和圖3（b）），但顯著程度的橙紅色的熒光所產生的線粒體探頭與賦予長通濾光片（圖圖3（c））。帶寬的30納米（活塞），50納米（賦予BP），和超過100納米（賦予LP），帶通和長通的GFP過濾組合，也可與多種合成熒光受光激發在可見光譜的藍色部分。

雖然綠色熒光蛋白一般可以與標準的熒光過濾器組合成像，如果強度足夠高，使用專門的過濾器（見圖3），將使微調信號采集，包括或排除其他組件。一個專門的過濾器組合的GFP定量成像應該使用排放窄帶通濾波器，以最大限度地提高熒光蛋白對背景信號（通常是自發熒光）。一個狹窄的帶通發射光濾光片，尖銳的藍綠色熒光蛋白的信號（圖3（a））與優先傳遞到該檢測器上（圖3（b）），或綠色橙色綠黃色（圖3（c） ）細胞自體熒光和其他熒光發射波長更長的背景。自體熒光通常具有非常廣泛，而綠色熒光蛋白的發射光譜相對較窄。原則上，最窄的帶通濾波器的選擇應比其他的背景信號增加熒光蛋白發射的歧視。然而，最佳的濾波器的通帶，將被限制了所需的信號與噪聲的比和檢測器的特征，如下面所討論。每個成像的情況，應確定最佳的帶通。此外，雖然圖3中所示，所選擇的特定的過濾器的組合增強型綠色熒光蛋白不僅依賴于信號強度，同時也對的熒光發射光譜輪廓的蛋白質變體（見表1）成像。

藍色熒光蛋白變種可以在寬視場熒光顯微鏡使用標準DAPI過濾器組合激發過濾器公司，在330至380納米范圍內成像，截止波長385至400納米，無論是帶通或長波發射濾光片色鏡（420納米以上）。這些過濾器的組合是非常有用的青色熒光蛋白，然而，與激發的藍紫光（400到440納米）的圖像的熒光基團的過濾器，以產生最佳的圖片。青色熒光蛋白的二色性反射鏡切割之間的波長455和460納米，以及傳輸460和500納米之間的光的發射濾光片。許多藍紫色的標準長通和帶通濾波器的組合可以的成功形象青色熒光蛋白衍生物（包括天藍和AmCyan1），，但顯微鏡和售后市場濾清器的廠家也提供了專門為這些探頭的自定義設置。

雖然黃色熒光蛋白衍生物（包括增強，金星和水晶）通常使用過濾器組合設計FITC和綠色熒光蛋白產生可接受的圖像，得到更好的結果時，吸收和發射波長稍長的配置文件顯示這些濾波器參數優化探頭。為黃色熒光蛋白的理想的組合是與跨越490至510納米的帶通區域的激發濾光片，二色性反射鏡與截止波長為515納米的，和發射濾波器通過在520和550納米之間的波長。à長波發射濾波器與截止波長為515納米或略高也將產生黃色熒光蛋白的良好形象。

橙色和紅色熒光蛋白的光譜剖面跨越一個大的波長區域，不幸的是，沒有一個單一的過濾器組合，是理想的成像的整個集合這些熒光。紅色熒光蛋白的熒光蛋白變體往往是與TRITC標準過濾器的組合，以及許多長通和帶通設置吸收可見光譜的綠色區域中的其他探測器設計的可視化。的橙色熒光蛋白成像（mOrange

在激光共聚焦顯微鏡，激發波長的選擇限制在一個狹窄的范圍內為每個儀器可用的激光線。典型的顯微鏡都配有兩個或多個激光器，跨越紫羅蘭（405和440納米），藍色（457，477和488納米），綠色（514和543納米），黃橙色（568和594納米），并紅（633和647納米）光譜區域。可以有效地使用這些激發波長激發表1中列出的熒光蛋白，這取決于可用的適當的二色性反射鏡和發射濾光片。多光子顯微鏡，也可利用圖像最流行的熒光蛋白的衍生物，在受限制的空間體積，這些工具的特征。

熒光蛋白過濾組合參數

表1

表1給出的是一個匯編顯示一些最流行的，潛在有用的熒光蛋白變種物業。隨著每個熒光蛋白的最佳激光波長線，以及建議的出發點的激發和發射濾波器帶寬（中心波長）的通用名稱和/或首字母縮寫列出。也包括在表中的相對亮度和推薦的二色鏡參數。是來自于該產品的摩爾消光系數和量子產率，EGFP的值除以計算出的亮度值。創建此房產已被科學和商業的文獻資源，目的不是要全面，而是代表熒光蛋白的衍生物，在文獻中得到相當的重視，可能證明是有價值的研究工作。

通常優選的定量顯微鏡的檢測器是光電倍增管和冷卻的電荷耦合器件（CCD）攝像系統。由于光電倍增管成像儀，光柵掃描（用于在激光共聚焦顯微鏡）必須執行整個標本逐點建立形象。或者，CCD圖像傳感器中的光電二極管陣列，產生二維圖像的大小的限制，僅由單個二極管元件的數量。除了從信號對噪聲的考慮，檢測器系統的最重要的方面是它的線性度和偏移。CCD陣列是兩個光電倍增管和高線性度和較高的高端相機系統，使調整的偏移量（通常被稱為黑電平），盡一切倍增配置。在實踐中，應調整偏移量讀取為零時，從檢體沒有熒光發射。如果有一個非零偏移系統中，它不會未能取得定量的圖像之間的差異。

在激光掃描共聚焦顯微鏡，光電倍增管通常具有較低的動態范圍（8位或256級灰度）和檢測效率（15％?30％）相比，到一個冷卻的CCD攝像系統。雖然這將是可取的，以增加檢測效率，8位的動態范圍通常不是一個問題，因為每個像素一般少于255個光子收集每個掃描（即使是很好的染色標本）。盡管如此，倍增的響應，同時加上適當的激光器的可用性與背景抑制性能卓越的線性度，使共聚焦顯微鏡的熒光蛋白定量成像的最佳選擇。多光子顯微鏡，從而消除相差的光損傷的焦平面上，以避免色差，提供了高分辨率的三維測量，熒光蛋白成像也是一種非常有用的工具。

最重要的參數是定義定量成像的效用的信號-噪聲比（簡稱S / N）。這個值是在現代商業熒光顯微鏡一般的散粒噪聲是來自于由檢測器收集的光子數的平方根被定義為。幾個系統誤差可能被引入在檢測系統中，但它們通常是比較小的散粒噪聲的CCD和光電倍增管。例如，如果一個檢測器收集每像素100個光子，噪聲將被預期為10（100）的平方根，或10％的信號。同樣地，對于噪聲（100）的10,000的每個像素的光子的信號，是信號只有1％。這些例子反映了典型的信號電平，在熒光顯微鏡中，在檢測電路中引入的誤差通常低于1％。一次出現時，它似乎是顯而易見的，最高的信號-噪聲電平是最可取的，但在現實中，因素，例如：光漂白，熒光團的飽和度，樣品中的熒光基團的數目和空間分辨率極限所得到的信號噪比。

在大多數情況下，以等于比例之間存在的熒光蛋白標簽，以及稠合的細胞靶蛋白。因此，在單元格中的熒光分子的濃度，可以計算出從作為參考標準使用已知濃度的重組熒光蛋白的細胞總熒光。增強型綠色熒光蛋白通常采用用于此目的，因為它的光穩定性和亮度。計算細胞內EGFP的濃度，已知量的標記可以被嵌入在聚丙烯酰胺平板細胞表達融合構建一起拍攝。參考的標準也已開發用于計算密度的膜結合蛋白，通過將準確數量的組氨酸標簽的綠色熒光蛋白包被的磁珠。蛋白表達的定量分析，隨著越來越多的熒光蛋白用敲的方法在整個生物標記分子利用，將成為越來越有用的技術。

選擇物鏡熒光蛋白成像

用于成像實驗設計協議時，雖然它可能是最重要的考慮，物鏡的選擇往往是最少量的思想。在確定可用的空間分辨率的圖像傳感器收集的光的量是最重要的物鏡的參數。在一般情況下，物鏡是由三個主要的標準：數值孔徑，放大倍數和光學矯正的程度定義。最不重要的參數放大倍率，盡管普遍的看法相反。放大倍數確定一個對象將出現在目鏡或探測器只大，但不發揮作用，分辨率（最小的細節，可以清楚地觀察）或亮度（將要收集的熒光信號的量）的圖像。

分辨率和亮度的數值孔徑，這是最重要的標準選擇一個物鏡函數。數值孔徑定義，將進入物鏡前透鏡的光的量，所以應選擇盡可能高的數值孔徑成像的熒光蛋白進行定量。圖像采集（任何形式的）背后的一般原則很簡單：作為信號噪聲比的增加，所以圖像質量。這個概念是特別關鍵的激光掃描共聚焦顯微鏡系統，其中收集的光子數量往往是相當小的（通常只有幾每像素）的圖像集合。因此，謹慎選擇適當的物鏡是優化光子收集策略時特別有用。請注意，圖像的整體亮度的平方除以放大倍率的物鏡的數值孔徑的四次方成正比。

圖4中所示的數值孔徑的原理的分辨率和圖像的亮度方面的重要性的一個例子。樣品是培養貼壁的人骨肉瘤上皮細胞（U2OS線）轉染的質粒載體編碼增強型綠色熒光蛋白融合到線粒體靶向的核苷酸序列從人類細胞色素C氧化酶亞基VIII。的質粒轉染的哺乳動物宿主的轉錄和翻譯后的線粒體定位信號是負責細胞線粒體網絡的熒光蛋白嵌合體在整個運輸和分配。管狀線粒體隨后可以可視化使用熒光顯微鏡。

在圖4中，使用具有相同的光學校正（方案螢石）和數值孔徑（1.3）的物鏡成像的相同的視場，但與從40倍到100倍的放大倍率。雖然在圖4中收集的圖像的像素和使用的檢測器的條件的數是相同的，線粒體是明亮的成像時，通過40倍物鏡（圖4（a））。相比之下，更高的放大倍率60X和100X的物鏡（圖4（b）和圖4（c），分別），100倍的圖像幾乎不產生逐漸變暗的圖像。此物鏡，仍然可以使用的圖像試樣，但檢測器的增益，必須顯著增加，導致惡化的信號 - 噪聲比，并通常次于圖像。請注意，物鏡的分辨能力（圖圖4（d）通過第4（f））是可比較的，因為在相同的數值孔徑值。

從圖4中的數據，將收集到的基本概念之一是避免過度的放大倍率，選擇物鏡時的熒光蛋白成像（和其他的熒光團，為此事）。簡單地增加數字放大（變焦），圖像采集過程中使用40倍的客觀結果共聚焦顯微鏡中的圖像大小相當于100倍的鏡頭（圖4（d）及（f）條）。這兩個物鏡的分辨率是一樣的，因為他們有相同的數值孔徑值。不應被視為相對次要的放大倍率參數表明，使用60倍或100倍的物鏡是不是有利。事實上，選擇高倍率的物鏡通常是必要的，當使用寬視場顯微鏡的成像非常小的物體，如過氧化物酶體或分泌顆粒，。由于圖像的大小相對于檢測器尺寸起著重要的作用，在確定空間的采樣頻率，確定的最佳放大倍率的數字照相機系統（CCD像素的大小和中間倍率）的參數。因此，物鏡的最佳選擇通常取決于儀器的光學結構的，除了一個特定的實驗的具體要求。

高度校正的物鏡（復消色差透鏡）的使用應慎重考慮，并盡量避免。色差和平整度的字段中包含的物鏡的典型的光學校正透鏡元件需要額外的矯正的程度的增加（例如，從螢石復消色差透鏡）。每增加一個透鏡，總的傳輸的光通過物鏡減小，這進一步限制了能夠到達探測器的信號的量。雖然高度校正透鏡的所需的專門的應用程序，如，高signal-to-noise比（并因此是一種特別的質量圖像）將更難獲得，多色成像，尤其是成像時的調光器的熒光蛋白質，如HcRed或ECFP。綜上所述，40x的螢石物鏡的（數值孔徑為1.3），優選為包含單一的熒光蛋白的成像標本，但多色實驗（兩個或更多的熒光蛋白），復消色差透鏡進行色彩校正的目的是必要的。

多色熒光蛋白成像

全彩色調色板的熒光蛋白的發展背后的主要推理是同時跟蹤兩個或兩個以上的細胞活動。鑒于日益增長的熒光蛋白的變種數量目前可用的（見表1），最佳配對可能不是很明顯。廣泛的激發和發射光譜的熒光蛋白和它們的顏色位移的遺傳變異體所表現出的公司通常需要專門的設計考慮因素時，這些獨特的探針同時使用兩個或更多的活細胞成像實驗。首要關注的是潛在的出血通過工件（實際上，從一個探針熒光外溢進入通道配置為第二個探頭）從重大通常表現出的熒光蛋白組合的光譜重疊程度。

滲色（通常稱為交叉或串擾）可以發生在兩個不同的熒光蛋白質的激發波長和發射。熒光探針檢查時，發生流血通過向藍端的頻譜（波長較短）的神器，而最明顯的是在較長的波長（紅端）排放。綠色熒光蛋白可以作為一個例子，通常可以檢測到通過紅色發射濾波器，但一般不使用綠色濾波器成像紅色熒光蛋白。出于這個原因，多色成像的熒光蛋白進行的最長波長的發射探頭想像第一，使用的激發波長不交叉的波長更短的探針。EYFP信號例如圖像EYFP和EGFP在同一單元中，使用氬離子激光，將首先收集在514納米的譜線，超出吸收的檔案EGFP，和排放聚集有530 - 550納米帶通濾波器。不是特別關鍵的，因為只有EYFP被激發的發射濾波器的帶寬。綠色熒光蛋白成像從477納米氬離子激光線，連同一個很窄的490至500納米帶通發射濾波器使用第二次掃描。該過濾器應正確定位，，到排除EYFP熒光，并允許特定EGFP（有點乏味的任務）的信號捕獲。雖然的488納米氬離子激光的峰值更接近的EGFP的激發最大值，它太接近到發射濾波器的帶通區域，從而與圖像采集的激光反射光的干擾的可能性。

成像兩個或兩個以上的熒光蛋白質時要考慮的一個重要點是帶過濾器的多色成像，需要認真注意，以控制出血通過熒光發射到意想不到的渠道。然而，應該指出的是，顯著限制濾波器的帶寬發生在信號噪聲（因為該集合帶寬受到嚴重限制）和由于需要單獨收集策略的時間分辨率為代價的。其次，專門的光學設計，往往特別是實驗，通常是必需的，以達到最佳的成像條件。例如，綠色熒光蛋白變異體的黃色衍生物的存在下收集所需的專門的過濾器的組合標準的共聚焦顯微鏡中并不普遍。由于熒光蛋白的數量和光譜剖面變化的持續增長，需要特定的過濾器組合將相應增加。

圖5中所示的一系列的同時與兩個或兩個以上的熒光蛋白融合到亞細胞定位的物鏡轉染的細胞系中拍攝的圖像。圖5（a）在HeLa細胞標記EYFP（核），的ECFP（高爾基），DsRed2FP（線粒體），三個探頭清楚地分隔廣角熒光濾波器組合用于捕捉圖像（尼康CFP YFP HYQ和Cy3 HYQ）。負鼠腎上皮細胞（OK）轉染綠色熒光蛋白（微管），ECFP（核），DsRed2FP（線粒體）和成像標準過濾器組合的特色在圖5（b）。同樣地，在圖5（c）圖中的兔腎細胞（RK-13 行），轉染EYFP（內質網），ECFP（過氧化物酶）和成像尼康CFP和YFP HYQ過濾器集。非洲水的貓鼬細胞（APM）在圖5（d）所示的細胞轉染綠色熒光蛋白（微管蛋白）和DsRed2FP（核），人骨肉瘤細胞（U2OS線;圖5條（e）），標有相同的核探頭沿與ECFP（線粒體）。最后，在圖5（f）轉染的幼倉鼠腎細胞（BHK細胞系）（過氧化物酶）和DsRed2FP（線粒體）與EGFP。所有精選如圖5的圖像被抓獲使用廣角熒光顯微鏡和尼康濾波器的優化組合適當的熒光蛋白。

雖然最亮的熒光蛋白類的綠色和黃色的（見表1），它們的光譜的極大值相隔僅由平均為20至25納米。多色實驗中使用成對的綠色和黃色熒光蛋白是可能的，但放氣通過過濾器的組合之間，成為一個顯著的問題。其結果是，不經常使用的綠色和黃色的組合在一起。其中最流行的雙探頭組合是青色和黃色熒光蛋白（ECFP和EYFP，參見圖5）。盡管ECFP比EBFP更亮，其使用呈現兩個優點在該ECFP被有效地激發的氬離子激光器的457納米線，探針不容易地（如在圖2中示出）的光漂白劑

結合綠色或黃色熒光蛋白，紅色熒光蛋白衍生物可以產生一個有用的，可以容易地分離與發射光譜探針配對。然而，應謹慎選擇紅色熒光蛋白的變種，由于成熟率差異。此外，因為DsRed的及其衍生物形成四聚體在體內預留，他們可能會產生意想不到的效果的生物學系統被調查的蛋白質（如比預期的其他細胞器聚集或本地化）。目前尚無有效的經驗法則可以預測是否將紅色熒光蛋白衍生物作為融合標簽，一些蛋白質可能齊聚，而別人不會容忍。對于僅使用熒光蛋白（圖5（a）和圖5（b））相結合，青色，黃色（或綠色），DsRed的三重標記提供了一個很好的解決方案。

成像光學熒光筆熒光蛋白

熒光筆熒光蛋白利用光學設計實驗時，應考慮的幾個重要方面，關于活細胞成像，顯微鏡配置，載體構建，和蛋白質的選擇，以優化圖像采集參數。這些獨特的探頭主要用于監測活細胞中的動態過程，這往往需要保持細胞培養顯微鏡舞臺上長時間處于亞健康狀態。各種專門的加熱成像室制作舞臺插入市售的長期細胞在顯微鏡維修，但研究者也必須考慮一些必要的輔助要求，如二氧化碳源，輕緊顯微鏡外殼，和振動隔離。總之，成功形象長時期的活細胞必要的實驗條件下，應仔細著手與光學熒光筆蛋白實驗前成立。

幾個光學熒光筆熒光蛋白可以成功地使用傳統的寬視場熒光顯微鏡技術成像，但嚴重的定量調查，涉及的漂白方法和光敏往往必須配備專門的激光系統的多光子共聚焦顯微鏡進行。具體而言，PA-GFP，PS-CFP，楓，EosFP，Dronpa所有需要近紫外或紫色的照明光活化或光轉化，但成像的蛋白質所需的較長波長的光源（藍色和綠色激發）。因此應配備的紫外或紫色激光，以及可見光激光器，發射藍色和綠色光譜線，共聚焦顯微鏡。

當下最流行的激光光學熒光筆配置，雖然紫外線高能量的氬氣，二極管泵浦固態二極管405納米，488納米氬離子，和一個543納米的氦氖，氦鎘激光可作為光敏（牢記潛在的細胞損傷工件可以用紫外線照射）。其他有用的成像激光器包括一些新的二極管和氦 - 氖模型和多光譜氪 - 氬系統。最好的多儀器配置與寬帶鈦藍寶石激光器的波長范圍在750納米到1100納米之間的可調輸出。

在圖6中示出的是光轉化的PS-CFP2 使用405納米二極管激光器的成像和轉換，以及氬離子488納米的譜線成像的和跟蹤的人的β -肌動蛋白的熒光蛋白融合產物與光轉換蛋白。融合構建質粒載體轉染表達打成絲狀肌動蛋白在活細胞成像室負鼠腎上皮細胞（OK）。圖6（a）示出了單電池的光轉化之前，用二極管激光器成像。感興趣的區域周圍畫一大截的肌動蛋白細胞骨架網絡（圖6（b）條;紅色框），然后用40％的激光功率在405納米照明。當二極管和氬離子激光器（圖6（b）條），成像的光轉換PS-CFP2融合蛋白，清晰可見的綠色熒光，對照未轉化的探針（藍色）。10分鐘后（圖6（c）），光轉換的肌動蛋白已經開始，并入感興趣的區域之外的長絲，并在30分鐘時（圖6（2））的細胞骨架網絡與光學熒光筆標記。

最有效的控制下進行的聲光可調諧濾波器（AOTF），它可以很方便地用來定義圓形，橢圓形，矩形或手繪選擇照射照明光轉換和光活化過程中的具體區域的劃分標本。AOTF還可以進行微調激光功率水平調節強度試樣，并能夠使用的技術被稱為高速通道切換或multitracking的順序掃描標本。這種方法使排放的順序激發和收集一些熒光探針，以避免出血，通過文物，更準確地單獨的發射光譜。

定義地區的廣角鏡的興趣，提出了更大的挑戰。研究級顯微鏡通常配備照亮選定區域中的試樣，可以進行調整的可變光圈，雖然用少得多的精度比共聚焦顯微鏡的聲光可調諧濾波器的系統。廣角儀器也必須配置專門的熒光濾光片組合以圖像的幾個光學熒光筆蛋白。相比之下，共聚焦和多儀器更適合定量分析細胞動力學，利用光電轉換和光活化技術比寬視場顯微鏡，因此應為這些應用的首選。

產生足夠高的熒光信號電平為最佳的圖像采集也是使用光學熒光筆時要考慮的一個重要因素。在這方面，可以采用的吸收摩爾消光系數和熒光量子產率的值的本機和光轉換蛋白物種，以此來衡量，以確定相對的亮度水平。例如，楓和mEosFP都具有相似的光譜帶寬配置的可見光光譜中的綠色（母語）和紅色（光轉換）地區。然而，楓的固有綠色形式大約有綠色mEosFP由于到一個更高的消光系數和量子產率的熒光發射強度或亮度電平的兩倍。因此，在光電轉換之前，成像信號 - 噪聲比楓遠高于mEosFP。光電轉換后，這兩種蛋白具有類似的亮度水平（見表1），并產生媲美的圖像。

在當前可用的光熒光筆蛋白，Dronpa，楓，mEosFP的是最亮的，其次是PA-GFP，在亮度電平的光轉換楓物種類似，但顯著低于天然蛋白。市售的PS-CFP2變種是大約一個半光亮如楓，而火種和PS-CFP蛋白質，無論是在本土和光轉換形式，是迄今最暗的光熒光筆，收益率只有約25％的亮度電平表現出的光轉換的楓（表1）。后者熒光筆生物物鏡具有低豐度的水平，或需要高成像速度的調查計劃時，應考慮的一個因素，在成像過程中，表現出顯著較低的信號信噪比。

結論

熒光蛋白成像工具，目前的電池使的細胞生物學家隨時監控在活細胞中蛋白質動力學，蛋白質，細胞器和細胞的行為提供了許多新的見解。這樣做，這些顯著的探頭已經迎來穩態和動力學顯微技術可以用來破譯途徑和機制的生物過程在細胞生物學的新時代。再加上突飛猛進的發展中的活細胞成像顯微鏡系統，包括微光電子倍增CCD相機，旋轉盤共聚焦儀器，狹縫掃描顯微鏡，舞臺設置在整個可見光的熒光蛋白成像和光學熒光筆和近紅外光譜區的與近實時精度。