顯微鏡：活體生物熒光成像技術
2020-09-04 09:31:30
一、 技術簡介
活體生物熒光成像技術是近年來發展起來的一項分子、基因表達的分析檢測系統。它由敏感的CCD及其分析軟件和作為報告子的熒光素酶以及熒光素組成。利用靈敏的檢測方法，讓研究人員能夠直接監控活體生物體內腫瘤的生長及轉移、感染性疾病發展過程、特定基因的表達等生物學過程。傳統的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數據，得到多個時間點的實驗結果。相比之下，可見光體內成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標（標記細胞及基因）的移動及變化，所得的數據更加真實可信。因其操作極其簡單、所得結果直觀、靈敏度高等特點，在剛剛發展起來的幾年時間內，已廣泛應用于生命科學、醫學研究及藥物開發等方面。
二、原理
活體生物熒光成像技術是指在小的哺乳動物體內利用報告基因-熒光素酶基因表達所產生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗ATP發生氧化反應，將部分化學能轉變為可見光能釋放。然后在體外利用敏感的CCD設備形成圖像。熒光素酶基因可以被插入多種基因的啟動子（promoter），成為某種基因的報告基因，通過監測報告基因從而實現對目標基因的監測。
生物熒光實質是一種化學熒光，螢火蟲熒光素酶在氧化其特有底物熒光素的過程中可以釋放波長廣泛的可見光光子，其平均波長為560nm（460～630nm），這其中包括重要的波長*過600nm的紅光成分。在哺乳動物體內血紅蛋白是吸收可見光的主要成分，能吸收中藍綠光波段的大部分可見光；水和脂質主要吸收紅外線，但其均對波長為590～800nm的紅光至近紅外線吸收能力較差，因此波長*過600nm的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動物組織被敏感的CCD camera檢測到。
三、操作方法
熒光標記的選擇
活體生物熒光成像主要有三種標記方法：熒光蛋白標記、熒光染料標記和量子點標記。熒光蛋白適用于標記腫瘤細胞、病毒、基因等。通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等。熒光染料標記和體外標記方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以標記抗體、多肽、小分子藥物等。量子點標記作為一種新的標記方法，是有機熒光染料的發射光強的20倍，穩定性強100倍以上，具有熒光發光光譜較窄、量子產率高、不易漂白、激發光譜寬、顏色可調，并且光化學穩定性高，不易分解等諸多優點。量子點是一種能發射熒光的半導體納米微晶體，尺寸在100nm以下，它可以經受反復多次激發，而不像有機熒光染料那樣容易發生熒光淬滅。
但是不同熒光波長的組織穿透力不同，如圖1所示，各種波長的光對小鼠各種器官的透過率，都在波長>600nm時顯著增加。而如圖2所示，在650nm-900nm的近紅外區間，血紅蛋白、脂肪和水對這些波長的光的吸收都保持在一個比較低的水平。因而，選擇激發和發射光譜位于650nm-900nm的近紅外熒光標記（或至少發射光譜位于該區間），更有利于活體光學成像，特別是深層組織的熒光成像。（推薦文獻： Nature Method, 2005, 2: 12 如何選擇合適的熒光蛋白； Science, 2009, 324: 804 錢永建教授研究成果-近紅外熒光蛋白，非常適合活體生物熒光成像）。
活體生物熒光成像主要有三種標記方法：熒光蛋白標記、熒光染料標記和量子點標記。熒光蛋白適用于標記腫瘤細胞、病毒、基因等。通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等。熒光染料標記和體外標記方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以標記抗體、多肽、小分子藥物等。量子點標記作為一種新的標記方法，是有機熒光染料的發射光強的20倍，穩定性強100倍以上，具有熒光發光光譜較窄、量子產率高、不易漂白、激發光譜寬、顏色可調，并且光化學穩定性高，不易分解等諸多優點。量子點是一種能發射熒光的半導體納米微晶體，尺寸在100nm以下，它可以經受反復多次激發，而不像有機熒光染料那樣容易發生熒光淬滅。
但是不同熒光波長的組織穿透力不同，如圖1所示，各種波長的光對小鼠各種器官的透過率，都在波長>600nm時顯著增加。而如圖2所示，在650nm-900nm的近紅外區間，血紅蛋白、脂肪和水對這些波長的光的吸收都保持在一個比較低的水平。因而，選擇激發和發射光譜位于650nm-900nm的近紅外熒光標記（或至少發射光譜位于該區間），更有利于活體光學成像，特別是深層組織的熒光成像。（推薦文獻： Nature Method, 2005, 2: 12 如何選擇合適的熒光蛋白； Science, 2009, 324: 804 錢永建教授研究成果-近紅外熒光蛋白，非常適合活體生物熒光成像）。
活體生物熒光成像CCD的選擇
選擇適當的CCD鏡頭，對于體內可見光成像是非常重要的。如何選擇活體熒光性價比*高的CCD呢？CCD有一些重要的參數：
1) CCD像素。CCD像素決定成像的圖片質量，像素越高，成像質量越好。由于熒光背景光較強，產生非特異性雜光干擾明顯，需要配有高分辨率CCD的相機。
2) 前照式還是背照式CCD。一般而言，背照式CCD具有更高的量子效率，但是只有在檢測極弱光信號優勢明顯（如活體生物發光成像），但在強光檢測中與前照式CCD無本質差別，還更容易光飽和，并且其成本較高的弱勢使其不屬于熒光檢測常規要素。
3) CCD溫度。制冷CCD分為兩種：恒定低溫制冷CCD和相對低溫制冷CCD。恒定低溫制冷CCD擁有穩定的背景，可以進行背景扣除；而相對低溫制冷CCD由于背景不穩定，一般不能進行有效的背景扣除。CCD制冷溫度越低，產生的暗電流越小，如圖3所示，當制冷溫度達到-29℃時，產生的暗電流已經低至0.03e/pixel/s。由于儀器自身產生的噪音主要由暗電流熱噪音和CCD讀取噪音組成，而目前CCD讀取噪音*低只能降至2e rms；因而更低溫度的CCD并不能明顯的降低背景噪音，而成本卻極大提高。
4) CCD讀取噪音和暗電流。CCD讀取噪音和暗電流熱噪音是成像系統產生背景噪音的主要因素，但是在熒光成像中，*主要的背景噪音卻是來自于熒光背景光。熒光成像信噪比的改善主要依賴于熒光背景光的有效控制和背景扣除技術（圖4）。 ‘
選擇適當的CCD鏡頭，對于體內可見光成像是非常重要的。如何選擇活體熒光性價比*高的CCD呢？CCD有一些重要的參數：
1) CCD像素。CCD像素決定成像的圖片質量，像素越高，成像質量越好。由于熒光背景光較強，產生非特異性雜光干擾明顯，需要配有高分辨率CCD的相機。
2) 前照式還是背照式CCD。一般而言，背照式CCD具有更高的量子效率，但是只有在檢測極弱光信號優勢明顯（如活體生物發光成像），但在強光檢測中與前照式CCD無本質差別，還更容易光飽和，并且其成本較高的弱勢使其不屬于熒光檢測常規要素。
3) CCD溫度。制冷CCD分為兩種：恒定低溫制冷CCD和相對低溫制冷CCD。恒定低溫制冷CCD擁有穩定的背景，可以進行背景扣除；而相對低溫制冷CCD由于背景不穩定，一般不能進行有效的背景扣除。CCD制冷溫度越低，產生的暗電流越小，如圖3所示，當制冷溫度達到-29℃時，產生的暗電流已經低至0.03e/pixel/s。由于儀器自身產生的噪音主要由暗電流熱噪音和CCD讀取噪音組成，而目前CCD讀取噪音*低只能降至2e rms；因而更低溫度的CCD并不能明顯的降低背景噪音，而成本卻極大提高。
4) CCD讀取噪音和暗電流。CCD讀取噪音和暗電流熱噪音是成像系統產生背景噪音的主要因素，但是在熒光成像中，*主要的背景噪音卻是來自于熒光背景光。熒光成像信噪比的改善主要依賴于熒光背景光的有效控制和背景扣除技術（圖4）。 ‘
自發熒光的干擾
在活體熒光成像中，動物自發熒光一直困擾著科研工作者。在擁有激發光多光譜分析功能的活體成像系統出現以前，科學家們被迫采取各種方法來減少動物自發熒光，比如：采用無熒光素鼠糧飼養小鼠、使用裸鼠等。現在，擁有激發光多光譜分析功能的活體成像系統，能夠輕松進行熒光信號的拆分，如圖5，食物、膀胱、毛發和皮膚的自發熒光能夠被有效的區分和剝離。激發光多光譜分析也可用于多重熒光標記檢測，實現一鼠多標記，降低實驗成本，并有效提高數據的可比性。
熒光信號的準確定位
如圖6所示，如果信號和靶標100%重合，這是科學家所追求的；但是，如果信號并不和靶標重合，而又誤以為正確定位時，這是科學的噩夢。也許，一個錯誤定位的信號，比沒有信號更加糟糕！
而同時擁有結構成像（如X光、MRI）和功能成像功能（如熒光、發光、同位素）的多功能活體成像系統，則讓您擺脫困境，準確定位熒光信號。如圖7所示，小鼠的X成像經過胃腸造影，可清晰地獲得胃腸的形狀和位置，將熒光信號和X光疊加，熒光和胃腸重合，可準確判定熒光定位在胃腸。
四、應用
在腫瘤方面的應用
它可以快速的測量各種癌癥模型中腫瘤的生長，并可對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測評估；可以無創傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉移瘤及自發瘤。如Hollingshead等利用人類膠質瘤細胞系U251構建U251-HRE細胞，其中的熒光素酶基因表達受可誘導啟動子的操控，低氧狀態為其誘導條件，因此在細胞處于低氧狀態下熒光素酶基因開始表達。將此腫瘤細胞sc于裸鼠體內，腫瘤增殖早期并無明顯熒光素酶表達，當腫瘤達到了300～500mg時，局部組織出現低氧狀態，此時可監測到熒光素酶顯著表達。這種方法不僅僅監測腫瘤本身，更重要的是可以監測腫瘤細胞所處的微環境。
在監測感染和炎癥方面的應用
熒光素酶基因標記病毒和細菌，利用活體生物熒光成像技術可以檢測到，并能連續觀察其對機體的侵染過程以及抗病******物和抗生素對其病理過程的影響。如Contag et等用細菌熒光素酶標靶沙門菌，并用活體生物熒光成像追蹤細菌感染。
活體生物熒光成像技術和細胞示蹤
活體生物熒光成像技術還可應用到免疫細胞、干細胞、細胞凋亡等研究領域。如Costa等通過活體生物熒光成像可以追蹤到T淋巴細胞聚集于中樞神經系統。
五、前景
活體生物熒光成像技術讓研究人員能夠觀察活體動物體內的基因表達和細胞活動，是將分子及細胞生物學技術從體外研究發展到活體動物體內的強有力手段，正在被越來越廣泛地應用于醫學及生物學研究領域。由于其檢測靈敏度極高，且操作簡單，費用相對低廉，因此在生物科學研究領域有著廣闊的應用空間。