的關鍵在于克服?200nm的衍射極限與GSDIM顯微鏡是打開和關閉的熒光基團，因此其時間間隔的連續閉。 在這種情況下，熒光團的電子積聚在亞，非熒光暗態（三重態和其他）應用程序由一個高功率激光束的。從暗狀態，分子返回隨機到基態，進入這是由顯微鏡檢測熒光的周期 - 即所謂的“閃爍”。 這些熒光事件被捕獲，然后隨著時間的推移。 為了獲得高分辨率的圖像，受衍射限制的事件是通過施加一個合適的算法讀出。 *后，*終的高分辨率圖像是通過繪制數千記錄事件（圖1）的測量位置的再現。

與GSDIM技術的橫向分辨率降低到20納米，可以實現。在實踐中，*終的分辨率取決于單個熒光團，它是依次由熒光團的性質和包埋介質確定的定位精度。 下面的等式[3]表明，定位的精度依賴于由一個單獨的熒光發射收集的光子數量：

ΔR表示顯微鏡/物鏡的衍射極限，正由一個單獨的本地化熒光團和ΔR發出的光子的數目短信的**熒光團的定位精度。

*后，獲得*佳的定位精度的目的是直接關系到一個）*大化每熒光團/事件發射的光子的數目和b）*大限度地提高熒光周期的*小光漂白的數量（=）的努力。 這些特性是由熒光團的性質的相互作用，影響暗狀態，因而閃爍性能的周圍嵌入介質基本上影響。

在三維GSDIM系統的柱面透鏡被引入到顯微鏡的光路中。 所得到的光學散光導致那些閃爍事件不屬于在焦平面的橢圓。 這是上面的焦平面事件的點擴散函數（PSF）是豎直細長的，而那些事件所下的焦點的PSF是水平伸長。 該軟件終于把每一個閃爍的事件具有鮮明的z坐標。 顯而易見的是，這種方法需要一個良好校準的采集每個閃爍事件和高定位精度。 因此，令人印象深刻的三維數據可以與一個優化的嵌入方法（圖2）來獲得。

圖2：微管和線粒體的三維GSDIM高分辨率圖像 
COS-7細胞（A）和假彩色編碼的MDCK細胞（B）的線粒體指示z位置0-800納米的微管。 細胞染色對αTubulin或ATP5B，都與AlexaFluor?647，并嵌入的Vectashield?/甘油三。為了進行比較，寬視場圖像中所描繪的相應三維*分辨率圖像的上方。 比例尺為10μm。

在GSDIM顯微鏡*重要的一步是讓幾乎所有的熒光團進入長期黑暗的狀態，這是依賴于特殊的嵌入介質。 一些目前已知的介質，如葡萄糖氧化酶混合或聚乙烯醇（PVA），降低的傾向在試樣分子氧的量。 氧作為一個三線態猝滅劑，從而減少了在三線態的熒光團的量。 這是GSDIM*適得其反，因為三重態的一個重要途徑黑暗狀態。 因此，在三重態熒光人口減少間接導致的定位精度和*終解決一個損失，因為更多的熒光處于“開”的狀態與*分辨率圖像采集過程中的干擾。

相對于其他高解析度技術，GSDIM顯微鏡的一大優勢是其受聘于普通光學顯微鏡方法標準的熒光基團和常規染色方法的用法。熒光和包埋劑的只有結合導致的局限性。 然而，目前使用的GSDIM介質已經允許的范圍非常廣泛不同的熒光團，甚至熒光蛋白的應用。然而，他們都有各自的優點和缺點（圖3） 。 例如*常使用的介質半胱胺或β-巰基乙醇胺（MEA）是適用于大量不同的熒光基團，但不幸的介質，必須用新鮮的和它的效率下降之后顯著6小時用量，從而導致減小的閃爍性能。 因此，尋找其他嵌入介質和合適的熒光團是要充分挖掘這一*高分辨率顯微鏡方法的巨大潛力的重要一步。

Vectashield? -一種另類的3D GSDIM鏡包埋劑

在這種情況下奧利弗等人 能夠識別安裝介質的Vectashield?（Vectorlabs?）作為dSTORM顯微鏡足夠嵌入介質。在這里，我們測試了，如果這個新的嵌入方法可以為3D GSDIM顯微鏡采用和搜索優勢相比，目前使用的介質。 此外，我們進行了系統的屏幕在使用的Vectashield?結合工作的其他熒光團。

值得注意的是，我們發現，熒光團對AlexaFluor?647和AlexaFluor?555（Life Technologies公司?）顯示，該包埋劑優異的性能與*高的定位精度在3D GSDIM優良的閃爍性能。 這與奧利弗等人的研究結果一致。與AlexaFluor?647和AlexaFluor?555，我們能夠產生令人印象深刻的3D GSDIM數據（圖5）。 同的Vectashield?，AlexaFluor?647和AlexaFluor組合相比，目前使用的熒光團配對像AlexaFluor?647和AlexaFluor?488在MEA或葡萄糖氧化酶混合?555甚至表現出***的性能閃爍。 這可以通過使用的Vectashield?或MEA分別為（圖4）進行，并強調這種包埋劑的巨大潛力事件列表兩個閃爍的圖像的對比進行可視化。

事實上，熒光一雙閃爍的性質是不是這種媒介的*大優勢：擁有的Vectashield處理標本?/甘油三可在4℃存放數月沒有任何損失其優良的閃爍性能（圖6）。

像它的相對強的自體熒光和由此產生的背景，尤其是在532 nm激光范圍的缺點，可以通過混合的Vectashield被削弱?與含緩沖甘油和50mM的Tris pH值8以1:10的比率。 以405nm的波長，它是用于增加熒光團的熒光的周期數所謂backpumping激光，通常不是必需的，因為其具有優異的的Vectashield?閃爍特性的任一AlexaFluor?647或AlexaFluor?555。 這也可以防止背景形成。

在我們進一步的研究，以確定其他合適的熒光團，我們發現，有趣的是，熒光蛋白EYFP可接受的閃爍性能堪比中葡萄糖氧化酶混合物的性能。

不幸的是，我們沒能找到其他的熒光團，尤其是在488納米范圍內，其中AlexaFluor?488和阿托?488沒有表現出預期的閃爍性能沒有。 至于仍然未經測試的考生和越來越多的熒光基團被特別設計用于*高分辨率顯微鏡的巨大數量，熒光團的數量有限的缺點，肯定會被削弱的未來。 作為MEA的情況下，與的Vectashield?組合閃爍熒光團的名單是肯定隨時間而不斷檢測生長。

COS-7細胞培養一天，在精度蓋玻片（Marienfeld的-高級?），然后固定用冰冷的甲醇中。 用PBS含1％奶粉的1小時的塊后，將細胞溫育在1:100在PBS中的比率是針對ATP5B（圣克魯斯?）和α-微管蛋白（Sigma公司?）初級抗體2小時/奶粉。 標注與AlexaFluor?647或AlexaFluor?555分別與*抗體，第二抗體在PBS中稀釋度為1:200孵育1小時。 除非奶粉塊中的每個步驟是伴隨著由四個洗滌步驟用PBS。

如描繪在圖7中，細胞包埋在的Vectashield?/甘油-TRIS-緩沖液（的Vectashield?和甘油-Tris-緩沖液中以1:10的比例;甘油以50mM的Tris pH值8），如下所示：75-100μL培養基被放置在凹部滑動的空腔。 然后將蓋玻片放置在低氣壓滑動朝向介質和抑郁癥的細胞。 在此步驟中，以避免任何氣泡是很重要的。 過量的介質必須由濾紙去除，以確保雙組分硅氧烷Twinsil?是能夠正確地干燥。 Twinsil的黃色和藍色分量?為1:1混合，然后施加到蓋玻片的邊緣。 10分鐘后，聚硅氧烷硬化和試樣準備好GSDIM成像。

由單個熒光事件的區域或時間間隔打破了衍射障礙已經徹底改變了光鏡。 在未來，不會有由于衍射極限更高的分辨率的限制，但顯微鏡與不斷減少的限制分辨率的發展揭示了新的挑戰，比如GSDIM顯微鏡的情況下，標簽或嵌入介質。 正如前面提到的，在所有的*分辨率方法的關鍵步驟是獲得熒光在黑暗的一面，這是基礎，良好的定位精度。 在GSDIM顯微鏡，這個過程主要是由包埋劑的存在所影響。 這里，嵌入介質和熒光團的性質之間的相互作用是成功的高分辨率成像的決定性因素。

如今，我們擁有**的熒光團配對像AlexaFluor?647和AlexaFluor?488在MEA或AlexaFluor?647和AlexaFluor中的Vectashield?555?/甘油-三，允許收購令人印象深刻的3D*分辨率圖像的兩種顏色。 在不久的將來我們與包埋劑的Vectashield?結合高效的熒光基團的劇目是一定要通過不斷試驗和實踐經驗進行擴展。 再加上像STED顯微鏡等高分辨率技術，這會給我們細胞生命和它的生化調控的一個**的觀點。