徠卡顯微鏡：熒光顯微鏡介紹
熒光顯微鏡的光學顯微鏡是一種特殊形式。它使用目標波長的光激發后發射光的熒光染料的能力。蛋白質的利益可以通過抗體染色或熒光蛋白標記的熒光染料標記的。它允許一個單一分子物種的分布的測定，其量和其在細胞內的本地化。此外，可以進行共定位和相互作用的研究，觀察到的離子濃度，使用可逆地結合染料，如Ca 2 +和呋喃-2和內吞作用和胞外分泌的細胞過程，如觀察。今天，它甚至可以將圖象分的幫助下，熒光顯微鏡的分辨率的顆粒
斯托克斯位移
熒光的一個重要特點是斯托克斯位移。它描述了一個令人興奮和發射的光子的能量水平的差異。由熒光發射的光子是一個令人興奮的光子的波長比更大。這是由于被激發后的熒光染料，但在此之前發射的光子的能量釋放到周圍環境中。由此產生的波長偏移，使得它可以令人興奮的和出射光之間的區分。可以被看作是具體特征的分子物種的吸收和發射的能量。
熒光顯微鏡
圖 1：通過熒光顯微鏡的光路
近年來，發光二極管（發光二極管）也被用作光源，用于熒光顯微鏡。由LED發射的光的波長取決于用于生產的材料。然而，在大多數情況下，需要的激發光濾光片，因為LED通常在一個相當寬的波長范圍內發射光。
大多數熒光顯微鏡落射熒光顯微鏡。照明器和物鏡被定位在試件的同一側，并通過試樣的光不通過。除了激發和發射濾光片，分色鏡，需要為這種熒光顯微鏡。甲二向色反射鏡，使目標波長的光通過，而其他波長的光被反射。過濾器和分色鏡經常一起插入在過濾器中的多維數據集。
激發光通過激發光濾光片和分色鏡。這反映了對試樣的光通過物鏡。標本中的興奮和熒光染料發出的光子。這個發射光線通過客觀的分色鏡。所發射的光具有適當的波長，并且能夠通過。由試樣反射的激發光，無法通過二向色鏡，會被阻塞。如果激發光能夠通過分色鏡將被阻塞，當它到達發射濾光片。可以測量的檢測器的發射過濾器的光通過。 在熒光顯微鏡中使用不同類型的過濾器。帶通，長傳和短通濾波器可以區分的。傳輸的頻帶的波長帶通濾波器，而具有更大或更小的波長的光將被阻止。長傳和短通濾波器邊緣過濾器。長通濾波器的長波長的光傳輸。與目標的截止值以上的波長的光將無法通過。相比之下，短通濾波器傳輸短的波長，并阻止長 圖 3，綠色熒光蛋白轉基因小鼠胚胎 圖 4：熒光原位雜交染色體。紅色：TRITC，藍色：CY5，綠色：FITC 熒光顯微鏡被廣泛使用，并提供了巨大的特異性。的各種技術使人們有可能以解決不同的問題，甚至規避，阿貝描述的衍射極限。 可確定的分子物種的本地化與助染色的細胞器，如細胞骨架或膜。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM），使得它可以觀察到在該樣本中沒有信號從外部的焦平面的區域，并允許光學切片。全內反射顯微鏡（TIRF）是一種技術，它允許接近到細胞表面的薄區域的觀察。在這方面的一個漸逝場激發的熒光染料。 觀察一個分子物種的動態變化的一種技術是熒光漂白后恢復（FRAP）。在一個受限制的區域的熒光染料的光漂白和未漂白的分子的擴散，進入此區域可以測量。熒光能量轉移（FRET）的顯微鏡，可以進行交互研究。一個興奮的捐助生色團的能量轉移到受體熒光激發它。如果兩者都匯集了非常密切的，這是*可能。如果這些染料被耦合到不同的蛋白質，它們只能夠傳遞能量，發出熒光的蛋白質，如果彼此交互。 技術，使受激發射損耗（STED）顯微鏡，地面狀態消耗（GSD）顯微鏡，單分子和基態耗盡顯微鏡由單個分子的回報（GSDIM），光敏定位顯微鏡（PALM）和隨機子高分辨率圖像光學重建顯微鏡（STORM）。子顯微鏡用于這些技術也被稱為作為nanoscopes，因為他們解決在納米尺度的圖像。 圖 5：Pukinje的細胞，矢狀節三重標記小鼠小腦皮質。紅色：anti-calbindin-D28k/Cy3，綠色環保：，藍色anti-GFAP/Cy5：赫斯特33258 圖 6：鼠標組織切片，自發熒光，熒光壽命microcsopy（FLIM）
在熒光顯微鏡中的不同的技術
