我們如何定義“熒光”？

在任何搜索引擎中鍵入“熒光的定義”這個短語，你會得到如下的短語或者非常相似的東西;

“由于X射線或紫外線等波長較短的入射輻射，某些物質發出的可見或不可見輻射。”

這個定義如何與熒光顯微鏡相關（圖1）“較短波長的入射輻射？”僅僅是用來“激發”樣本中的熒光團的光源。這種光可以包括可見光譜，紫外線（UV）和紅外線（IR），顯微鏡中的光源可以從汞燈或氙弧燈到激光器。所述的熒光團（“某些物質”在上述的定義）是具有特殊性能，由此它們可以由具有較低波長的光激發后再發射更高波長的光/光子的化學化合物。

圖1：通過熒光顯微鏡觀察熒光標記的細胞。

波長的基本單位是儀表，“波長”定義為光波的兩個連續波峰或波谷之間的距離。波長的符號是希臘字母lambda（l）。在顯微鏡中通常使用的波長在400-700nm之間的可見光譜范圍內的納米（nm）范圍內，在400nm以下的UV光譜和在700nm開始的IR光譜（圖2）。

熒光團按其激發和發射波長分類，通常以顯示最大峰值的圖形的形式存在。熒光基團在所謂的“基態”中是天然穩定的。當它們吸收光子（來自“較短波長”的光）時，光子的能量將熒光團的電子升高到更高能量的“激發”狀態。被激發的電子不會保持這種狀態，而是在返回到基態時失去振動能量并發射更長波長的光子。對于顯微鏡中使用的熒光團，從激發到返回到地的一個完整周期占據0.5到20納秒的區域。

熒光團激發和發射波長通常縮寫為帶有下標“ex”（激發）或“em”（發射; l_ex或l_em）的希臘字母λ 。

每個熒光團都具有不同的最大激發和發射光譜，并且該屬性用于區分相同樣本中的不同物鏡。例如，使用熒光染料DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）來突出細胞中的核蛋白以及熒光標記的鬼筆環肽以突出顯示肌動蛋白細胞骨架。

熒光的Jablonski圖

波蘭物理學家亞歷山大·賈布朗斯基教授（Aleksander Jablonski，1898-1980年）是第一個用三級能量圖來描述地面/激發/發射之間的循環的方法，簡稱為“雅布倫斯基圖”。1930年，他在華沙大學獲得博士學位，主題為“論激發光波長變化對熒光光譜的影響”。1933年，他發表了他的論文（“染料中的反斯托克斯熒光的效率”），其中包含了Jablonski圖。熒光團行為的這種簡單而有效的說明突出顯示了從基態到激發態的激發以及隨著更長波長的光子的發射而回到地面（圖3）。

圖3：熒光Jablonski圖。熒光團可以吸收光子。光子的能量將熒光團的電子升高到更高能量的“激發”狀態。隨后，被激發的電子在返回到基態時失去振動能量并發射更長波長的光子。

雖然圖3是一個簡化的Jablonski圖，但應該指出，熒光團可以存在于許多不同的激發和發射狀態。此外，取決于分子的電子自旋，熒光團可以經由稱為“ 三重態 ”的不同放松狀態返回到地面。

斯托克斯位移

喬治·加布里埃爾·斯托克斯爵士（George Gabriel Stokes，1819-1903）是愛爾蘭的數學家和物理學家，在他一生中，他在光學和光學領域取得了許多發現和進展。他于1849年被任命為劍橋彭布羅克學院的盧卡遜數學教授，直到1903年去世。他寫了一篇精美的描述性文章，于1852年出版，名為“關于光的可變性的變化”。本文中使用的語言不同于我們在現代科學文獻中使用的語言。以下是斯托克斯使用的精彩語言的兩個簡短摘錄。

“到了去年秋天，當季節的晚些時候提供了很少的觀察的機會，我從不同的來源得知，那種已經被提及的具有如此高程度的內部分散性的黃色玻璃是用鈾的氧化物著色“。

和：

“看到管子一下子變成了無形的光芒，它真的是一個奇怪的景象：它實際上是黑暗可見的，總而言之，這種現象有一種神秘的外觀。

“斯托克斯位移”后來被命名為他的榮譽。當激發的電子返回到基態并發射光子時，波長總是比用于激發熒光團的波長更長。這是由于波長與輻射能量成反比的光的特性。斯托克斯位移描述峰值激發和熒光團的峰值發射波長（圖4）之間的差值（單位為納米）。 

隨著斯托克斯位移的增加，區分熒光團的激發和發射成比例地更容易。熒光團在斯托克斯位移方面具有獨特的特征，這是由于它們的電子構型和分子結構。

綠色熒光蛋白的發現和使用

斯托克斯首先用“熒光”這個詞來形容他所觀察到的現象，但是這個歷史可以追溯到1565年。西班牙的一位醫生和植物學家尼古拉斯·蒙那德（Nicolas Monardes）描述了一種奇怪的藍色，腎臟。盡管有這些早期的觀察，但是在400年后的今天，一種綠色熒光物質被報道在一個活的有機體中。在1955年Davenport和尼科爾發表的一篇論文  描述水母稱為類的子類的嗜酸性粒細胞的組織上相水螅。當時，這項工作的作者并沒有意識到嗜酸性粒細胞含有綠色熒光蛋白（GFP）。

直到1962年，小森下村（* 1928）發表了一篇文章 ，其中相關成分被認為是一種蛋白質。與他在普林斯頓大學的教授（Frank Johnson）一起，他們從生物發光水母Aequorea victoria收集樣品。他們有獨特的方法從熒光蛋白中分離熒光蛋白，即通過棉布袋擠壓孤立的生物發光組織，產生下村被稱為“擠壓”的溶液。

1994年，哥倫比亞大學的Martin Chalfie（* 1947）教授編寫了一篇論文，證明編碼GFP的基因可以在原核和真核細胞（即大腸桿菌和秀麗隱桿線蟲的神經元）中功能性表達。該論文指出：“因為這種熒光不需要外源底物和輔因子，所以GFP的表達可以用來監測活體中的基因表達和蛋白定位。正是這一出版物為廣泛使用GFP在生物學研究上鋪平了道路。

圖5：C.elegans，GFP在神經系統中的表達

一年之后，圣地亞哥Califronia大學的Roger Tsien教授（1952-2016）（曾研究野生型GFP的突變體）在自然界的科學通信中發表了他的研究成果。Tsien及其同事選擇了這種單點突變（S65T）的發現，因為它具有最長的激發和發射波長（490/510nm），使其更具光穩定性，并導致眾所周知的GFP激發/發射峰。

2008年，Shimomura，Tsien和Chalfie共同獲得諾貝爾化學獎，他們的角色和發現GFP。當Shimomura做了他的諾貝爾演講時，他說：“當我在1979年發現GFP的發色團時，我認為我已經盡了我所能做的所有GFP，并決定終止我在GFP上的工作，以便集中精力去研究生物發光”。他繼續承認：“綠色熒光蛋白是一種美麗的蛋白質，但在發現后的30年內，它仍然沒有用。”

自從Tsien的發現以來，他的實驗室設計了許多GFP變體，覆蓋了很多可見光譜，并且確實革新了光學顯微鏡和成像領域。由于這樣的基因工程，GFP的顏色范圍從藍色部分（EBFP; 380/460 nm）到黃色部分（YFP; 514/527 nm）。 

探針

與成像領域一樣，熒光團可以用作“記者”來研究細胞和生物體中的基因表達。酶螢光素酶以及編碼GFP的基因是通常用于檢查特定基因是否由細胞表達的那些。用遺傳修飾的病毒DNA或在靶基因表達時發熒光的質粒轉染生物體或細胞。細胞內的感興趣的細胞器或部位可以在轉染的細胞中可視化和檢查。

用熒光團標記（或“標記”）的抗體通常稱為“ 熒光探針 ”。在廣泛使用GFP和發現之后的其他熒光團之前，兩種最常用的標記抗體的熒光團是FITC（異硫氰酸熒光素）和TRITC（四甲基羅丹明異硫氰酸酯）。盡管FITC和TRITC仍在使用，但是在這一領域已經取得了重大進展，熒光團和探針的選擇至少是非常廣泛的。

當然，實驗室中使用最廣泛的熒光團之一是“Alexa Fluor”染料。可用的Alexa Fluor染料的當前范圍跨越可見光譜范圍從346到784 nm的激發波長。 

量子點

量子點（或“Qdots”）是1981年由俄羅斯科學家阿列克謝·埃基莫夫（Alexey Ekimov）在玻璃矩陣中首次發現的，同時在圣彼得堡的瓦維洛夫州立光學研究所（Vavilov State Optical Institute）工作。然而，量子點的第一個膠體溶液是由位于新澤西州AT＆T貝爾實驗室從事半導體工作的Louis Brus發現的。他現在是哥倫比亞大學化學教授。在1983年和1984年發表的兩篇論文中，Brus描述Qdots為“小型半導體微晶”。

量子點表現出獨特的方式 - 盡管它們含有少至100到100000個原子，但它們表現出的性質好像是由單個原子組成的。但是，它們確實符合熒光團的性質，從而它們能夠吸收光能，在返回基態時被激發并釋放出光子的光子。但是它們發射的光的波長取決于Q點的尺寸，Q點越小，發射波長越短。這個性質是由于更小的Qdots具有更大的“最小帶隙”。這是激發電子到更高能態所需的能量的量。由于較小的量子點需要更多能量用于激發，所以隨后發射更低波長的光（波長與激發能量成反比）。

幾乎是20年后的2002年，Qdots成為加利福尼亞Quantum Dot Corporation的生命科學研究人員的商業化產品。

量子點是用于熒光應用的非常明亮和穩定的工具。研究表明，量子點比傳統熒光團亮幾個數量級，盡管與有機染料相比，它們的亮度有一些變化。在光穩定性方面，量子點報道比傳統熒光團穩定多達100倍，在一次體內成像研究中，它們仍保持熒光長達四個月。

在常規熒光探針中，一個或多個熒光團可以連接到單個感興趣的抗體。然而，由于Qdots的表面積非常大，許多分子和抗體可以附著到單個點上，這可能具有許多優點，包括熒光信號放大。量子點的使用也提供了多重檢測的優勢，在多重檢測中可以同時對多種波長進行成像。在這樣的測定中，唯一的變量是由研究人員選擇的Qdot的大小（以及因此的發射波長）。可以使用白光同時進行大量Q點的激發，否則會使用多個激光器并進行許多調整以形成最終圖像。