徠卡顯微鏡入射光熒光顯微鏡里程碑
落射熒光顯微鏡
約翰·塞巴斯蒂安·普洛姆1927年出生在薩瓦倫托（蘇門答臘），是一名荷蘭煤礦工程師的兒子。在幼年時期，他和父母一起回到了荷蘭，在那里他創作了繪畫作為他的激情之一。高中畢業后，他發現了另一個迷人的色彩領域，我們將在稍后學習。普洛姆決定學習醫學，并在烏得勒支，哈佛和阿姆斯特丹接受教育。之后他在邁阿密和阿姆斯特丹大學工作，之后被提升為荷蘭萊頓醫學院的教授。
在他的研究活動中，他發現熒光顯微鏡是一個**的工具。在20世紀60年代，特殊類型的標本照明開始流行起來，事實上，早在1925年，Policard和Paillot就已經知道了這種照明，他們對絲蟲的自發熒光事件感興趣（Policard and Paillot，1925）。一些研究人員重新啟動了兩名法國科學家的項目，將熒光照明和樣品檢測放在顯微鏡的同一側。這種使用入射光的原理被稱為“落射照明”“與透射顯微鏡相反。使用這種技術用于熒光顯微鏡的一大優點是避免檢測由光源傳送的發射光（圖1）。另一個好處是具有更多的機械特性：在透射照明中，聚光鏡和物鏡有兩個分開的光軸，必須仔細對準。在落射照明中，物鏡是：聚光鏡和光收集物鏡。像這樣，可以避免對齊問題。
圖1：熒光顯微鏡中epi-照明的好處：在透射照明（左）的情況下，光源和圖像檢測位于目標的相反側。使用這種設置，一個明顯的限制是激發光（淺藍色）的不必要的檢測。相比之下，Epi-Illumination（右圖）使用照明目標以及圖像檢測。對于熒光顯微鏡來說，這意味著用戶不會暴露于激發光。
分色光束分光鏡
幾年前蘇聯的兩位研究人員已經提供了熒光落射照明顯微鏡的一個非常重要的輸入。Brumberg和Krylova開發了一種用于入射光紫外激發的所謂二色分光鏡（Brumberg and Krylova，1952）。二色性材料能夠讓某一波長范圍的光線通過，而其他波長的光線則被反射（圖2）。
這個原理對于熒光落射照明是不可或缺的，因為激發光必須以某種方式融合到顯微鏡的光路中（圖3）。更確切地說，二向色分束器對于來自光源的期望的激發光的波長是不可穿透的并且將激發光反射到樣本。來自樣本的熒光又可以將二向色分束器傳送到檢測側。
圖2：透射圖說明了二向色分束器的功能。反射較短波長的光（藍色箭頭），較長波長的光（紅色箭頭）可以通過濾波器。
圖3：熒光落射照明需要能夠將激發光（藍色）反射到樣品并將發射光（綠色）傳遞到檢測側的分色鏡（灰色）。激發光的波長可以用相應的濾光片（橙色）預選。面向檢測側（紫色）的過濾器專門使熒光團的波長通過，并排除來自激發的剩余雜散光。
不幸的是，由于鐵幕之間缺乏信息交流，普洛姆不知道俄羅斯的發展。盡管如此，他自己也開始使用二色分光鏡。在Ploem的特殊情況下，他和著名的特種玻璃Schott（美因茨）生產商一起開發了一種分光鏡，它反映了藍光和綠光（Ploem，1965）。之后，他用Leitz公司提供的中性分束器修改了一個“Opak”落射照明器，通過引入一個帶有四個不同二向色分束器的滑塊，他可以實現紫外，紫光，藍色和綠色（Ploem，1967）（圖4）。
圖4：帶有四個分色器的熒光多波長落射照明器，安裝在滑塊上，用于紫外，紫色，藍色和綠色激發光的入射照明。修建在阿姆斯特丹大學（1965年，Ploem）。
熒光濾光激發塊
二向色分束器的發展以產生具有離散波長的激發光具有重要的優點。紫外光譜（?100nm?380nm）的激發在當時是非常普遍的，但具有惱人的副作用：自發熒光。許多組織物質被紫外光激發，導致微弱的背景發光（圖5）。通過將分色鏡的反射波長擬合到綠色或藍色范圍，Ploem能夠達到在那些時間非常普遍使用的兩種熒光染料FITC（494nm ）和TRITC（541nm）的激發*大值，而沒有產生自發熒光。FITC（熒光素異硫氰酸酯）和TRITC（四甲基羅丹明-5-（和6） - 異硫氰酸酯）可以與抗體偶聯，并仍然用于免疫熒光顯微術。通過在很小的范圍內激發它們的*大值，組織標本的對比度顯著增強（圖5）。用Ploem的二向色分光鏡產生的激發光束如此有效地擬合到FITC的激發*大值，甚至可以使用具有相當差的發射光譜的光源。
圖5：左側：用寬帶UV激發照射標記有免疫標記（FITC）的組織細胞。注意藍色自體熒光的組織結構。右：使用窄帶藍色（490nm）光照射epi照明的FITC標簽具有相同的組織和相同的免疫染色。注意增加的圖像對比度（Ploem，1967）。
考慮到這些事實，現在有可能通過應用藍色和綠色的窄帶激發，利用普通高壓汞弧燈供電，利用落射照明的優點。這種增強滿足了即將到來的生命科學和醫學熒光顯微鏡的需求。
Leitz出于應用Ploem的發明，設計了一種新型的多波長熒光落射照明裝置，配有四個旋轉的二向色分光鏡，可以在紫外線，紫色，藍色和綠色的光線范圍內激發樣品：Leitz PLOEMOPAK。
Leitz員工W. Kraft完成了進一步的成就，他將一個二向色分束器與適當的激發和發射過濾器結合在一個工件中，即所謂的過濾器立方體或激發塊（Kraft，1969 und Kraft，1972） 6）。他的調查結果是設計了一個落射照明器，其中有幾套這樣的濾光片立方體，它們仍然是當今所有多波長熒光顯微鏡的基礎。
圖6：左圖：Leitz員工W. Kraft于1970年左右將激發濾光片（橙色），二向色分光鏡（灰色）和發射濾光片（紫色）放在一個工件 - 濾光片立方體中。中間：過濾器立方體的工程圖。右圖：在現代顯微鏡下，熒光濾光片立方體可以輕松地進出。研究人員甚至可以根據自己的需要，用不同的濾光片和二向色分光鏡來修改立方體。
概要
憑借Ploem及其同時代人和接班人共同構建的技術基礎，我們今天享受到通過將足夠的濾光片放入落射照明器中觀看無數不同熒光團的特權（圖7）。研究人員甚至可以建立自己的立方體，根據需要定制激發和發射參數。
由于現代研究顯微鏡的自動化，在實驗過程中切換濾光片立方體不過是點擊一個按鈕。科學家們可以在不同熒光基團之間切換，因此甚至可以觀察到不同基因表達熒光標記的活標本。
圖7：熒光顯微鏡的演變。左：透射光的熒光顯微鏡的基本問題是激發光的檢測。中間：這就是為什么人們利用落射照明將光源移動到顯微鏡的檢測側。這種方法需要一個二向色分束器。右圖：將激發濾光片，發射濾光片和二向色分光鏡組合成一個區塊便于快速切換專用于某些熒光團的不同區塊。