徠卡顯微鏡在透明的動物更深刻的見解

透明的生物幫助我們確定空間布局和細胞和組織，尤其是神經回路可以很容易地被識別和表征的連接。徠卡顯微鏡凈度是大家議論的焦點。VIVIANA Gradinaru，助理教授，加州技術研究所，進一步發展的方法和最近被渲染整個嚙齒動物體透明度引起了轟動。在這次采訪中，她對清算戰略及其對現代科學的影響的進展評論。

圖1：腦細胞：熒光標記的腦細胞內的一個完整的腦組織3-D可視化。通過使用這種新的全身結算及染色方法，研究人員可以使生物體的組織透明 - 讓他們期待通過生物體特定的細胞已被標記或染色的組織（來源:Bin Yang and Viviana Gradinaru） 。

你已經參與了最初的CLARITY出版卡爾戴瑟羅特。什么是您在清晰的發展中的作用？

我開始導致凈度與卡爾戴瑟羅特談話后2010年初該項目。這是在實驗室中唯一的非光遺傳學的項目，因此需要不同的基礎設施。與此同時初步的實驗，我建立一個新的建筑，也就是現在的數控程序（包括生化，外科，顯微能力）的家中一個特殊的CLARITY實驗室。

在開始的時候，只有Charu萊瑪克里斯南，研究助理和實驗室經理，我的工作項目。但它需要高度跨學科的技能。所以，卡爾期待通過他的博士后申請者找人化學工程專業知識（尤其是水凝膠，這是我們認為可以用來支持清組織），并發現申請人他的實驗室誰想要工作在干細胞和光遺傳學項目，但誰也有化學工程專業。這是Kwanghun涌佐治亞理工學院，誰加入了我們作為一個博士后，大約一年后到項目中。和Logan Grosenick，例如加入了我們的專業成像，硬件和軟件明智的。Kwanghun然后執行它作為第一代凈度的驅動力。

通過引入水凝膠拿出擺在首位清算組織的想法是怎樣？

最初我們想使神經網絡耐用UND刪除元素分心觀察。因此，我們旨在指導神經元建立一個內骨骼，例如通過表達角蛋白或甲殼素，應該穩定細胞結構的大腦已經被取出后。需要支持的水凝膠。水凝膠包埋的兩個想法并為特定的神經元回路的更簡單的可視化去除元件已經在主**和描述了利用卡爾戴瑟羅特箱。在那個時候，我們認為器官結構使用低滲休克，內切酶消化，熱等的消化遠離目標內骨骼結構。我們認為，更多的立體支持，應通過任何合適的基質，如膠原蛋白，樹脂或水凝膠的支持。在我們的工作中，我們注意到，該水凝膠本身，這結束了丙烯酰胺，是足以穩定組織結構和更好（更深）的可見性可以通過除去脂類而得到。

你有沒有注意到影響CLARITY會對科學在那個時候？

是。想想對線蟲，或斑馬魚的所有研究，認為可以很容易地識別基因突變及其對器官發育和存活的后果：之前我們已經學到了很多，從自然透明的生物。有些這樣的工作被認可了諾貝爾文學獎于2002年。不幸的是，翻翻哺乳動物組織是不是同樣一件容易的事，由于光散射血脂是目前全厚組織，包括細胞膜，使機關不透明。

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• 圖2：腎細胞：熒光標記的腎細胞內的一個完整的腎組織3-D可視化。通過使用這種新的全身結算及染色方法，研究人員可以使生物體的組織透明 - 讓他們看看通過一個有機體已經標記或染色的特定細胞的組織（（Yang等，2014）。信用：細胞，Bin Yang and Viviana Gradinaru）。
  

能否請您介紹的進步協定，凈度呢？什么是克服挑戰？

PACT 僅被動凈度，以調整，使該水凝膠的孔大，以加快被動脂質去除和增加抗體的穿透。我們試圖清除組織，而無需使用一個電場，它原來的方法使用的，但在挑戰來實現，并可能損壞組織。

你是如何開發RIMS？

我們最初的論文中使用FocusClear。然而，許多實驗室努力實現方法是擔心缺乏可用性和成本。我們開發的輪輞（折射率匹配液），使我們和其他人的工作更容易和經濟實惠的。RIMS是一種經濟實惠的替代FocusClear，研究人員可以在實驗室中，也可以不破壞熒光用來存儲樣本數月。這是說，我們的樣品也給了很好的效果，當在一個簡單的山梨醇溶液（我們稱之為成像sRIMS我們給在紙上的配方為好）。

如何全身結算所PARS工作？

在小區目前的報告是建立在CLARITY方法來實現整個成年機體清除和染色。這是可能的，因為本征循環系統（例如脈管系統）可以用于實現結算而不是洗滌劑和標簽的被動擴散，這將是大的器官或整個生物體過于緩慢的實現。這是PARS方法，簡稱P erfusion輔助一個紳士? elease在S ITU。

嚙齒動物的血管路由用于介紹和分發所需的解決方案：固色劑，洗滌緩沖液，水凝膠的解決方案和SDS清潔劑和緩沖劑。甚至抗體染色，通過心臟灌注完成。對大腦和脊髓的結算，我們建議顱內灌注進入腦脊液路線（PARS-CSF）。整個過程可以在2個星期的時間最大可以實現。大部分器官在幾天內清楚。并且這種方法也可應用到其它生物 - 例如人尸體 - 雖然成像和數據分析可成為隨卷調查的瓶頸。

什么是克服主要挑戰是什么？

還有我們不得不照顧三個主要問題：保護組織的完整性，其中包括防止器官變形和精細的軸突或表位的損害，達到最低蛋白質和核酸的損失和保留，在適用時，內源性熒光 - 所有這些，同時還清理組織比被動的結算將允許更快。雖然透明度，映入眼簾的是結算的一個粗略指標 - 完全透明組織是不是主要目標，因為overclearing也可以發生在組織的完整性成本。我們清除了足夠的樣本來檢測的分子標記物，包括RNA轉錄的單分子分辨率。

這些是什么新穎的光學結算方法給出科學的可能性？其中新的應用領域，你的未來看到了什么？

一個透明的全生物體是特別有用的映射在其靶器官的整個身體內的分布和外周神經的分子身份; 這樣的神經然后可以與光遺傳學在疾病的動物模型調制理解什么需要調諧，以改善癥狀和所得到的知識，可以促進依賴于，例如更好的療法，電刺激神經更好器官功能或用于減少慢性疼痛。雖然這是很難預測的研究將如何迅速進步，達到臨床試驗階段，有大量的動力和積極性。制藥公司越來越熱衷于創造光遺傳學的單位，我們也有在PARS結算，這甚至可以在人體組織中使用的興趣。我們誰是從誰死阿爾茨海默病或癡呆的患者使用的凈度（PACT）在人腦組織中被動形式合作者。我們還表明，它的工作原理，從一個人的皮膚癌患者檢測癌細胞的活組織檢查。希望通過組織與細胞和蛋白質的分辨率可以讓我們對病理進展很大 - 這是邁向更好的治療方法的第一步。

你的主要研究重點是光遺傳學。如何做光學結算和光遺傳學結合起來？

PARS補充光遺傳學的，因為它可以揭示光遺傳學操作的電路全效果，也有助于在需要調諧在疾病映射新穎電路。

在光遺傳學，我們修改了嚙齒動物大腦的神經元，使他們響應和光誘導的模式生物在一定的行為。當你閃耀一盞燈，在神經元激發。當你把它關掉，神經元停止射擊。我們希望從光遺傳學，詳細了解大腦是如何的功能。研究大腦的動物模型功能，如鼠類，增加了我們人類的大腦是如何工作的理解 - 而且，有了它，我們設計出更好的治療腦相關疾病的能力。

一個主要的挑戰是確定其顯示處理后的治療效果的電路。我們沒有穿過大腦連接的詳細地圖。這可能是一個問題，因為我們的腦深部刺激現有光遺傳學研究表明。這電腦深部電刺激可能會從根本上采取行動，通過腦白質遠離電極部位突出了需要更好的大腦地圖。然而，難以創造這樣的地圖為束狀整個大腦運行良好時，軸突做到這一點的常用方法是切片的組織中紙一樣薄的薄片，再成像各一臺，并與圖像處理軟件把它全部背起來：它是緩慢的，乏味的，昂貴的且易于出錯。清除組織使我們能夠可視化和鑒定細胞成分和它們的無切片分子的身份。

該視頻顯示在不同深度的逐步的橫截面圖像在整個熒光標記的完整腸組織。在這些圖像中，血管被標記為綠色，細胞被標記為紅色，并且細胞核被標記為藍色。使用PARS技術圖像拍攝（來源：楊斌和VIVIANA Gradinaru）。