在考試和數字錄音的乘法標記熒光標本、 兩個或更多的排放過程中信號往往可以重疊的*終形象因他們接近的接近度內的微觀結構。這種效應被稱為定位，通常發生時標記的熒光分子將綁定到躺在非常接近或相同的空間位置的物鏡。高度特異性的現代合成熒光和古典免疫熒光技術，加上精密光學切片和數字圖像處理馬力共聚焦和多光子顯微鏡，所提供的應用極大地改善生物標本中檢測定位的能力。

共定位，在生物的表現形式，是由居住在標本中的同一物理位置的兩個或更多不同分子的存在而定義的。范圍內的組織切片、 單個單元格或在顯微鏡下查看的亞細胞細胞器，定位可能表明分子都連接到的相同的受體，但是，在數字成像技術，是指發出的熒光分子共享相同的像素在圖像中的顏色。在共聚焦顯微鏡標本被記錄作為數字圖像組成的一個多維數組，包含很多體積元素稱為體素表示三維像素為單位）。體素 （或檢測卷） 的大小是由物鏡、 照明波長和共聚焦檢測儀針孔直徑的數值孔徑確定的。因此，定位在一個標本，例如 Alexa 氟 488 有兩個熒光探針的綠色發射和 Cy3 與橘紅色的排放，是在圖像中以像素表示的含 （經常產生各種色調的橙色和黃色） 這兩個紅色和綠色的顏色捐款。

作為一個例子，給出了在圖 1 中的圖像序列說明了在橫向光學平面 (x-y軸在激光掃描共聚焦顯微鏡)紐蛋白，與粘著和黏著路口相關蛋白與細胞骨架蛋白肌動蛋白的定位。這些配合服務作為肌動蛋白微絲的形核部位和外部介質、 質膜和肌動蛋白細胞骨架之間的交聯劑。圖 1 (a) 從 Alexa 氟 488 (絲狀肌動蛋白) 興奮與 488 納米氬離子激光器是從探測器通道發射譜的 Alexa 氟 568 （紐蛋白） 進行篩選，當興奮 543 納米氦-氖激光，而圖 1 (b) 是經過篩選后收集熒光發射的渠道收集的掃描。數字相結合的兩幅圖像 （圖 1(c)) 顯示的兩個熒光信號在絲狀肌動蛋白纖維的總站共定位。

它是重要的是注意到那定位不是指的可能性，與類似的發射譜的熒光團將出現在相同的像素設置在復合圖像中。準確定位分析是*可能如果熒光發射光譜要很好地與分離之間熒光團，正確的篩選器集 （或光譜狹縫寬度），使用期間的習得順序。如果譜的流血，通過工件存在因為一個高度光譜之間的重疊熒光發射譜，或由于使用了不正確的篩選器組合，共定位測量將變得毫無意義。為了避免工件，熒光分子必須仔細相匹配照明源 （共聚焦顯微鏡在激光線） 的功率譜，同時仍保持有用程度的發射波長之間的分離獲得的*大激勵效率。在大多數情況下，熒光共定位分析的明智選擇中獲得滿意的結果至關重要。

在圖 2 中，提出了一種比較光譜重疊為一系列的 Alexa 氟染料組合在定位實驗中可能會有用。所有的發射譜的比較，正常化，重疊區域由灰色底紋的指示。在圖 2 (a)，為綠色熒光 Alexa 氟 488 和橘黃色熒光 Alexa 氟 555 染料發射譜表明峰值波長，通過人的眼睛也很容易區分的清晰分離。然而，光譜互相重疊 （灰色陰影區域） 的適度水平說明了，有相當多的排放量從 Alexa 氟 488 發射波長峰值在 Alexa 氟 555 （由一條黑線從發射峰跑到橫坐標表示）。這種高水平的信號流血，通過呈現分離的探頭在 Alexa 氟 488 的熒光發射強度明顯大于 Alexa 氟 555，會發生大量的因素，包括熒光物鏡人口較大差異的情況下很難。結果，這些探頭的組合應該避免定位在實驗中，或使用只有當圖像在同時加工方面的共聚焦模式下，以減少或消除流血，通過獲得。

Alexa 氟探針之間的光譜重疊隨發射極大值之間的帶寬增加，如圖 2 (b) 所示。在這種情況下，Alexa 氟 488 和深紅色熒光 Alexa 氟 633 表現顯著降低的程度的重疊時相比，圖 2 (a)。這兩種染料很容易區分對人的眼睛和光譜重疊的程度低應該效果不好與*小流血，通過定位在實驗中，條件是每個探頭的濃度是類似 （請注意，Alexa 氟 633 的深紅色熒光可能很難想象通過顯微鏡目鏡在低濃度時）。Alexa 氟 633 由 633 納米線的紅色氦-氖激光，*有效地激發，但也可以用黃色的氦-氖激光的 594 納米線。也許*好的光譜分離中可見發光 Alexa 氟染料是 Alexa 氟 488 和 Alexa 氟 647 (不說明) 的結合。這些染料之間幾乎沒有光譜重疊和流血，通過工件應該是缺席，甚至含有過多的標本中各級 Alexa 氟 488。熒光探針具有這些特點是配備了適當的激光共聚焦顯微鏡的共定位調查的理想人選。

決定定位在共聚焦顯微鏡觀察的能力被有限的光學系統的分辨率和用于照亮試樣的光的波長。視場熒光和共聚焦顯微鏡具有理論分辨率大約 200 毫微米 （0.2 微米），但在實踐中，這個數字下降到 400 和 600 納米的各種原因，包括顯微鏡、 折光指數波動、 光學畸變和不當的試樣制備的不同心度之間的一個值。在幾乎所有情況下，然而，**調諧的共聚焦顯微鏡的光學分辨率限制并不足以確定兩個熒光分子是否附加到一個單一的物鏡或是否他們甚至駐留在相同的細胞器。高度特異合成探針或抗體靶向本地化和定義良好的細胞結構，很容易受歧視的周圍設計了很多實驗協議。其他人產生標本與顯示探針之間的重疊程度高的地區。

對于是小于 5 微米的厚度，如貼壁細胞或非常薄的組織切片的標本定量定位分析往往是可能的在常規視場熒光顯微鏡。然而，對于較厚的標本，圖像應記錄作為光學切片的有限的軸向尺寸，以確定是否看似讓出熒光團實際上駐留在同一側的焦平面或他們是否垂直疊加*過對方沿顯微鏡z-軸。熒光團厚厚的標本中的共定位分析應由獲得使用激光掃描或旋轉磁盤共聚焦或多光子顯微鏡光學切片。多光子儀器往往能夠激發這兩個熒光雙標記標本中與單一的近紅外激光譜線在焦點的物鏡高度定義卷中。這個**的功能限制到居住只在焦平面，這將大大減少光漂白工件和背景噪音的熒光的熒光發射。

共定位分析軟件

熒光共定位在一個標本的程度被衡量通過比較中獲得的圖像的每個的等效像素位置的顏色值。在分析過程中的*步涉及到將賴以進行定位測量，無論是從兩個獨立的通道單波長并購 （*技術） 或乘法標記的樣品作為一個單一的形象獲得派生復合材料作為圖像顯示。檢查時有兩個以上的標簽的標本，在一個單一的計算，期間處理的只有兩個 pseudocolors，但所有的偽彩色排列可以隨后被選為對的共定位分析。通常情況下，由于傳統使用的氬離子、 氬、 氪和氦-氖激光，有譜線能夠有效地令人興奮的強烈吸收在藍色和綠色區域的熒光共聚焦熒光選擇紅綠雙。此外，人類的眼睛是綠色和紅色的顏色組中的色調更敏感。

共定位分析的 pseudocolored 的標本圖像圖形顯示方便代表由散點圖（有時稱為fluorogram），與相關的關系或兩個數據集之間的關聯。一個散點圖圖的一個偽彩色 （或通道） 與另一個用于每個像素在圖像中，強度或所選的區域的利益，在二維直方圖上 （見圖 3 和圖 4）。一個通道 （通常是綠色的） 用圖表表示沿x-軸，而其他 （通常為紅色) 在y上繪制-強度從 0 到 255 的橫坐標和縱坐標軸。因此，由一對強度作為坐標可分辨的特點復合圖像每個像素是在笛卡爾坐標系統中。由的強度對生成的分布格局的分析可查明的熒光共定位，以及背景歧視、 流血，通過、 漂白和缺乏登記之間的各個通道。

圖 3 顯示了三個雙通道共聚焦顯微鏡光學切片圖像平面 （pseudocolored 紅色和綠色） 從標本有不同程度的熒光共定位，以及其相應的散。有非常低強度每個通道中的像素位于原點 (0，0) 附近的散點圖，亮的像素被分散遠和跨整個關系圖。在紅色和綠色通道關聯一個散點圖，純紅色和綠色像素為單位） 傾向于集中附近的軸的情節，而讓出像素為單位），如果存在，出現彩色與橙色和黃******調 (取決于定位的程度），與落在中心附近 (x = y） 和右上角的散點圖。

圖 3 給出了的標本包括大鼠大腦海馬冠狀厚斷面標記有 Alexa 氟 488 （神經絲） 和 Alexa 氟 568 （膠質纖維酸性蛋白 ；膠質纖維酸性蛋白，圖 3(a))。印度麂鹿皮膚成纖維細胞染色 Alexa 氟 568 靶向紐蛋白和 Alexa 氟 488 共軛對鬼筆 （絲狀肌動蛋白) 中說明了圖 3 (b)，而兔腎上皮細胞 （RK 13行） 共同表達熒光蛋白，DsRed 和 EYFP，定位于細胞核，描繪在圖 3 (c)。關聯的散位于下方的標本圖像 （例如，圖 3 (d) 是為圖 3(a)) 的散點圖和定位兩個通道的程度由白色字母和數字在左下角的每個散點圖。在圖 3 (a)，并逐步更高程度的定位功能系數的大約 30 ％ 和 85 ％，分別在圖 3 (b) 3 (c)，注意到相對缺乏的定位 （只有兩個通道的一對夫婦 %）。

散點圖分析熒光共定位使用的典型軟件提供的共聚焦顯微鏡及成像程序制造商的售后所顯示的圖像在圖 4 中，這使用印度麂堿性成纖維細胞細胞染色與 Alexa 氟 568 （紐蛋白 ； 紅色通道） 和 Alexa 氟 488 （絲狀肌動蛋白 ； 綠色通道） 生成的序列概述。感興趣區域的選擇是為分析在散點圖，如圖 4 (a) 中的白色矩形由表示。這一地區設置門檻水平的信號，將包括在大多數定位軟件程序所進行的分析。

概述了感興趣的領域的水平和垂直邊緣應保持一致，要排除背景信號，聚集沿x軸和y-軸的散點圖。僅從包含在所選區域的邊界內的像素所產生的信號分析的定位估計。試樣中的像素區域重疊容易轉換成一個定位二值化閾值掩碼 （圖 4(b))，可以疊加在圖像 （圖有賴于作為定位地圖。地圖圖 4 (c) 所示的閾值部分顯示讓出的領域在白色的但這種顏色可以隨時改變與大多數軟件應用程序到生產更高程度的對比與原始的 pseudocolors 的另一種顏色。

如上所述，使用從散獲得和所選的信息可以獲得定量評估的熒光定位在共聚焦光學切片的感興趣區域。幾個值生成使用的整個散點圖的信息，而其他人都來自像素值包含在所選區域感興趣。用于分析的變量之間的整個的散點圖是重疊的皮爾遜相關系數 （比），是重疊的為了描述的兩種模式之間度匹配到另一個圖像模式識別中的應用的標準技術之一。皮爾遜相關系數是根據公式計算的：

(1)

S1在哪里像素為單位） 中的*渠道和S2的信號強度是信號強度的第二個通道中的像素。S1(average)和S2(average)的值分別是*和第二次的通道中的像素的平均值。在皮爾遜的相關性，從原始的強度值中減去平均像素強度值。其結果是，此系數的值范圍從-1 到 1，值為-1 表示完全缺乏從圖像，像素和的值為 1 指示**圖像配準之間的重疊。皮爾遜相關系數僅占形狀兩個圖像之間的相似度，并不取決于圖像的像素強度值。當將此系數應用于共定位分析，然而，潛在的負面值是難以解釋，需要另一種辦法來澄清分析結果。

更簡單的技術往往被用來替代的相關系數計算涉及到消除減法的平均像素強度值從原來的強度。定義正式的重疊系數 （R），此值范圍介于 0 和 1 之間，則對圖像分析中的強度變化不敏感。重疊系數的定義為：

(2)

通道強度在分子中的產品返回一個值，顯著，只有當兩個值都屬于一個像素所涉及的共定位 （如果這兩個強度大于零）。因此，方程（2）的分子是成正比的 colocalizing 的像素數。以類似的方式，重疊方程的分母是成正比的像素數從這兩個組件在圖像中，不管是否存在定位 （注：組件的定義的紅色和綠色的圖像或像素陣列從通道 1 和通道 2，分別）。重疊系數的一個主要優勢是其對各種組件的形象，往往產生的熒光染料濃度波動、 漂白、 量子效率變化和非等效電子通道設置，信號強度差異的相對不敏感。

使用重疊系數的*重要的缺點是比率的每個通道中的圖像特征的人數之間的**影響力。為了減輕這種依賴關系，重疊系數被劃分成兩個不同分項系數，稱為k(1)和k(2)表達的共定位程度作為兩個獨立的參數：

(3)

重疊系數、 k(1)和k(2)，描述強度之間的渠道，與k(1)正在敏感中的通道 2 強度的差異 （綠色信號），而k(2)線性依賴于從通道 1 （紅色信號） 像素的強度的差異。到目前為止所描述的方程是重疊的能夠產生程度有關的信息和可以帳戶的強度變化之間的顏色通道。為了估計在讓出領域整體量讓出熒光圖像的一個顏色通道的貢獻，一組額外的共定位系數、 m(1)和m(2)的定義：

(4)

共定位系數m(1)被采用描述讓出的地區，從通道 1 貢獻系數m(2)是用來描述從通道 2 同樣的貢獻。請注意變量S1(i,coloc)等于S1(i)如果S2(i)是更多比零，反之為變量S2(i,coloc)。這些系數是熒光復合圖像，相對于該通道中的總熒光每個通道中的 colocalizing 熒光團的數量成正比。即使時在兩個圖像通道的信號強度有明顯不同的層次，共定位系數m(1)和m(2)是可以確定的。

共定位系數第二雙可以為像素強度范圍劃定在散點圖上的感興趣的區域由定義的計算。系數M(1)被用于描述信道 1 熒光讓出的區域，所作的貢獻，而M(2)用來描述信道 2 熒光基團所作的貢獻。這些定位系數的定義如下：

(5)

在哪里S1(i,coloc)等于S1(i) ，如果S2(i)在于興趣閾值 （左、 右兩邊的矩形 ROI） 的區域內和等于零，如果S2(i)表示一個像素以外的閾值水平。同樣， S2(i,coloc)等于S2(i) ，如果S1(i)在于興趣閾值 （頂部和底部兩邊矩形 ROI） 的區域內和等于零，如果S1(i)感興趣的區域外。換句話說，對于每個通道，分子表示也有一個組件從另一個通道，該通道中的所有像素強度的總和而，分母表示所有強度的總和從通道。這些系數是 colocalizing 中的對象的每個通道的復合圖像，相對于該通道中的總熒光熒光的量成正比的。

商業上可用的定位軟件分析程序的大部分是能夠計算出的參數，上文所述，包括皮爾遜相關系數、 總重迭系數，以及個別k(x)、字母和字母定位系數。另外，許多程序都包含應用背景減法校正，生成的整個形象，散和/或執行單一的雙通道復合圖像或沿軸向平面光學堆棧上使用選定的感興趣區域的計算的算法。*重要的數據輸出，從這些軟件包是重疊的的共定位系數、 指示信號之間的相對程度。例如，定位系數值為 0.75 的熒光體在通道 1 表示有一個通道 2 組件，除以所有通道 1 強度，總和的所有通道 1 強度的比例是 75%。這是定位的相對較高。同樣的值為 0.25 為通道 2 熒光指示定位 （等于三分之一的通道 1 熒光） 顯著降低的的級別。

文物和標本共定位分析中考慮的因素

共定位分析時遇到的*重要的文物中是光譜流血，通過發射譜重疊、 自體熒光 （主要是在組織標本），和特異性抗體或合成熒光染色。熒光共振能量轉移 （煩惱） 也是一個潛在工件與讓出熒光團有緊密的重疊譜線輪廓。這些工件的任何有能力生產圖像像素出現黃色或橙色，但不是來自共定位，檢查標本用綠色和紅色熒光探針標記。

也許*常見的問題是流血，通過熒光強度的時成像具有兩個或更多的熒光標簽的標本。例如，當雙標記與傳統的綠色和紅色探頭，熒光素和羅丹明，流血，通過只可以通過使用優化的熒光篩選器設置，減少，但永遠不會完全消除了。這種效應是重疊的由于這樣一個事實，這些染料有很廣泛的吸收光譜和發射光譜，表現出很大程度。因此，激發熒光使用氬離子激光器 488 納米光譜線也將產生勵磁羅丹明，雖然程度較輕。此外，熒光發射將設置預留羅丹明，生產出現黃色或橙色甚至在定位缺席的情況下的像素的光電倍增管通道或視場篩選器中檢測到。為了進行這些的定位實驗和類似熒光團，流血，通過工件必須完全消除。

與流血，通過在傳統熒光團 （如熒光素和羅丹明） 相關的問題通常可以通過使用更新的生物學上的改進和光明合成探測器，如 Alexa 氟家庭或碳菁 (Cy 系列) 染料克服。許多這些專門設計的有機分子的陳列很窄的發射譜 （相比于傳統的探頭），恰逢弧光放電燈的大消光系數和激光光譜線、 改進的量子產率、 減少的漂白和熒光排放對環境變量的更少依賴。此外，這些*的探頭均可提供激勵譜線，橫跨大約 400 納米，從紫外到近紅外，確保各種各樣的選擇，以配合照明光源與*小排放光譜重疊帶寬。

熒光，顯著得多用甲醛固定組織標本，產生類似的外觀，以流血，通過工件。勵磁常常展出自體熒光試樣的結果在檢測中排放的其他渠道，產量似乎已經讓出熒光團的圖像。過度背景染色的抗體和合成熒光團也可以像在那里兩個熒光團都表現出高度的非特異性染色的區域定位。這個工件可以通常會避免或者，至少，大大減少通過仔細制備樣品和監測議定書 》 與適當的控制。

共定位調查所有流血，通過、 自體熒光和非特異性熒光工件已經被淘汰，每次只可以考慮準確。*有效的辦法是聘請序貫勵磁在共聚焦顯微鏡掃描配置，以收集與窄帶發射篩選器 （或窄縫寬度為分光儀器） 發射信號。同時，應檢查單標記控制標本，以確保完全消除的流血，通過和未染色的控件可以有效地監測自體熒光。流血，通過校正軟件是可用于很多的共聚焦顯微鏡，使校正而被捕獲的圖像。

為各種標本，說明在圖 5 中流血，通過工件及他們在激光掃描共聚焦顯微鏡的更正。在圖 5 (a) 提出了一種對成纖維細胞描繪流血，通過 Alexa 氟 488 （綠色熒光） 的進 MitoTracker 紅色 （紅色熒光） 打算當標本與氬離子 （488 納米光譜線） 和綠色氦-氖 （543 納米線） 激光掃描，同時產生黃色肌動蛋白微絲的通道。序貫掃描和檢測 （圖 5(d)) 流血，通過消除了。同樣地，流血，通過在厚厚的小鼠腸道 （圖 5(b)) 發生與同時掃描使用 Cy3 和核探針，DRAQ5，加上綠色和紅色的氦-氖 （633 納米線） 勵磁。按順序掃描標本 （圖 5(e)) 中刪除偽裝成共定位的流血，通過工件。

在哪里使用*過兩個的激光掃描多標記的標本的情況下，流血，通過工件通常可觀察到幾個頻道，數字披露和 5 (f) 為的厚厚的 Alexa 氟 488 （神經絲）、 Alexa 氟 568 （GFAP） 與 DRAQ5 標記的大鼠腦中所示 （核）。流血，通過時，會出現第二和第三渠道標本被同時掃描與三個激光器 （圖 5(c))，指示潛在的共定位之間在這標本的中間絲。然而，在啟動順序掃描和數據收集，時花絲只出現在他們各自的渠道 （圖 5(f))，消除的熒光定位在這些結構中的注意事項。

熒光共振能量轉移，從理論上講可以測量短的距離之間兩個密切定位熒光團，也是非常有用的工具，用于監測定位。然而，這種現象可以經常導致工件共定位分析期間除非必要的 FRET 的具體參數是很好理解，仔細考慮在實驗的設計過程中。具體而言，調查人員應該關注的時候使用探針有譜線，占領相同的帶寬，特別是在那里的*次的熒光發射譜與激勵譜的第二個重疊的區域。這些標本的能量轉移被表現在從*個熒光基團和類似的意外增加熒光發射意外下降為第二個探測器的排放強度。密切相關的熒光團之間的互動也可以導致淬火的發射的熒光信號，取決于環境條件。

經過認真的樣品制備技術可以規避的許多潛在工件定位分析中。如上文所討論，應選擇熒光探針，廣泛有*小的重疊分離發射譜線。如果可能的話，選擇綠色的熒光，有一個狹窄的排放標本 （如 Alexa Fluors 或量子點） 和深紅色或近紅外區域發出紅色熒光。小學和中學的抗體必須測試的交叉反應性非特定背景染色。應優化加載合成熒光團和標記二級抗體的濃度，以確保類似的亮度水平，尤其是當物鏡豐度是完全不同。影響熒光亮度因素是激發效率、 量子產率、 消光系數、 濃度、 以及環境因素，如 ph 值、 離子濃度、 疏水性、 和粘度。對照標本應該也準備與每個熒光基團分別和分別為流血，通過分析和自體熒光表征染色的缺席。仔細注意小細節，在染色的協議將會減輕康復通過收購后加工算法的數字圖像的必要性。

實踐方面的共定位分析

在審查和分析復雜的熒光圖案，采用聯合偽彩色顯示是非常有用，因為已在上文敘述的。通常情況下，兩個顏色通道被選中，*常見的是綠色和紅色的所以，重疊區域出現黃色。其他顏色配對，如藍色和綠色 （高產青色） 和藍色和紅色 （產生洋紅色），還可采用，卻是少得多有效的視覺檢查減少人眼對反射藍色波長的敏感性。然而，在許多情況下，特別是與三色圖像，使用藍色通道偽彩色是不可避免的。

在規劃中的圖像采集與顯示參數，應采用標準以便合并的圖像表現出相同的動態范圍和每個熒光信號偏移量。事實上，標準共聚焦顯微鏡觀察實踐表明這種方法為所有日常樣品分析。一旦結合，重疊的紅色和綠色信號如果收集了足夠的光子會產生明確的亮黃色信號。光子餓在實驗中，所產生的暗黃******調讓出熒光團，與平等貢獻的綠色和紅色的背景將出現棕色。

應分別調整每個通道的偏移和增益控制 (的背景設置為零和飽和度到 255），每個熒光顯示使用完整的 8 位 （256 灰度級） 范圍。然后能夠處理和合并單獨的圖像。雖然這是一種方便的方法來獲取和顯示彩色圖像，試樣中的兩個信號的相對振幅不能確定，因為每個信號的收購來填充圖像的整個位深度。因此，給定的顏色通道內的相對信號強度的分析將需要的渠道，進行配置以類似的方式在光電倍增管電壓、 增益和偏移量的問候。

如果不平衡的采集和處理的技術，關于合并后的彩色圖像中定位不準確解釋可以導致從不當增益和偏移量的配置的光電倍增管期間采集或由于極端直方圖拉伸圖像處理過程中。例如，如果黑級 （偏移） 值太高，不同的顏色分割可以發生低的黑色級別設置和降低的對比度條件下觀察，在相同的結構。為關鍵的應用程序，可以應用比率成像技術來區分，是讓出的信號和信號，只是部分地重疊。

**對齊的熒光成像系統將作為精確地注冊，像素的像素，在使用不同的篩選器集時，探測器圖像試樣中的點源。然而，工件如不足顏色校正的物鏡或差對齊的過濾器可以導致丟失注冊期間顏色合并，熒光信號之間的經常辨認顏色的均勻位移。對于具有復雜的圖案和混合物的明亮和昏暗的信號的圖像，這種效應可以去未被發現，從而導致信號結構的分布是不同或部分重疊的結論。

位移偽影可以減輕 （操作被稱為平移） 的圖像處理過程中的合并后的圖像恢復注冊使用許多可用的軟件包。對齊一組顏色層通過平移的能力需要在標本中的每一層都存在重合參考點的存在。如果乘沾上的參考點不存在，多色熒光乳膠微球可以添加到在高稀釋收益每人學視域與蓋板玻璃安裝前的幾個珠子的標本。為關鍵的應用程序，單個篩選器集與多帶通二向色鏡和障礙篩選器可用于不同的激光或特定于熒光染料的激發過濾器所有的熒光信號。這種配置在共聚焦顯微鏡中使用，適用于視場熒光色彩校準在哪里是關鍵。

在圖 6 中所示是幾個上文討論過的常見工件常常妨礙準確定位分析標本用多個熒光團 （請注意在圖 6 中的所有熒光組合都發出只有綠色和紅色熒光） 標記中。人類女性骨肉瘤上皮細胞 （u2線） 轉染增強黃色熒光蛋白融合到過氧化物的靶向性的多肽序列 （綠色熒光），和隨后 immunofluorescently 用共軛對 Alexa 氟 568 （紅色熒光） 針對過氧化物酶體膜蛋白 （PMP-70） 的二次抗體標記中呈現的數字 6 (a) 和混亂。圖 6 (a) 中的圖像的黑色水平設置為太高，從而導致降低強度為黃色熒光蛋白標簽。這種錯誤扭曲共定位分析產生的重疊像素從綠色通道人工低可探測的水平。適當層次分明的圖像所示圖混亂，演示顯著更高程度的定位。

在恒河猴腎上皮細胞 （LLC MK2線） 的線粒體網絡共同轉染增強的黃 （EYFP） 與HcRed1熒光蛋白載體靶向線粒體的肽序列。在成像，過程中多亮 EYFP 急劇黯然失色的熒光信號從 HcRed1，這是弱幾乎 100 倍，當探測器渠道有類似電壓、 增益和偏移量的設置 （圖 6(b))。調整中 HcRed1 探測器來平衡的熒光蛋白熒光光譜強度的通道值克服了這種差異，揭示了大量的定位 （圖 6(e))。請注意在調整后的圖像相比，支配與緊密匹配通道捕獲的圖像的綠******調熒光的黃色外觀。

錯誤登記的重疊的頻道所示圖劃定為 · 塔赫爾卵巢細胞 （HJ1。Ov線) 沾滿 Alexa 氟 488 共軛對鬼筆 （綠色絲狀肌動蛋白) 和 Alexa 氟 568 二次抗體靶向抗粘著斑蛋白鼠標 (焦粘連)。肌動蛋白絲兩端應腫瘤與紐蛋白在此標本，但他們的不稍有注冊的圖件，是用在圖像的右下角的紅色和綠色熒光標記微球。發布采集圖像處理要對齊的渠道 （圖 6(f)) 共定位分析還原圖像配準 (和微球的） 產生*的候選人。

結論

之間在進行調查的熒光基團時要考慮的*重要的點定位是確保標本貼標的盡可能高的質量。應該分析和選擇的特異性、 低的背景下和缺乏交叉反應性抗體和合成熒光團。為了減少流血，通過工件，熒光探針組合與廣泛分離發射譜是*適合用于定位實驗。適當的控制，包括標本用標記每個探頭單以及污泥而不染的自體熒光標準，應編寫和流血，通過在實際的實驗條件下的審議。一旦試樣參數進行了優化，可以解決儀器和軟件方面的考慮。它是重要的是記住可憐的試樣的制備通常不能由數字圖像處理技術克服。在大多數情況下，貼標條件的完善將節省大量的時間和*終產量**的結果。

談到的儀器配置要求，*高質量的復消色差顯微鏡物鏡是減少色差，會消極地影響定量定位計算所需。許多制造商已經介紹了計劃復消色差的物鏡在整個可見的光的波長區域 （400-700 納米），大大有益于定量熒光顯微鏡調查矯正色差。熒光發射的所有篩選器應具有與熒光譜線輪廓匹配的帶通傳輸特性進行優化。這是一個*重要的考慮因素，控制流血，通過從其他熒光試樣中。如果流血，通過檢測到控件 （單探頭和自體熒光） 中，順序掃描的標本用顯微鏡配備聲光可調諧濾光器 （AOTF） 為 multitracking 將產生*佳的結果。在某些情況下，流血，通過軟件校正可能有必要在進行定位分析之前。