熒光蛋白越來越多地被作為非侵入性探針在活的，由于他們有能力進行基因融合到有關蛋白質的本地化，運輸和動力學研究細胞應用。 此外，熒光蛋白的光譜特性是理想的測量使用福斯特的技術（或熒光）共振能量轉移（FRET）顯微鏡細胞內分子相互作用的可能性。 因為能量轉移被限制為小于10納米的距離，FRET的檢測提供了關于融合蛋白的亞分辨率尺度的空間關系的有價值的信息。 這種互動式教學探討熒光蛋白作為潛在的熒光共振能量轉移伙伴的各種組合，并提供有關關鍵的共振能量轉移參數，以及用于顯微鏡的光學過濾器的建議和光源配置信息。

教程初始化在廣角模式與當前流行的FRET對的吸收和熒光發射光譜，增強型青色和黃色熒光蛋白（ECFP，標記的供體 ;和EYFP，標記的受體 ）中出現的光譜信息窗口疊加在發射光譜的汞弧放電燈（藍色線譜）。 供體發射光譜和受體的吸收光譜之間的光譜重疊區域被示為具有垂直線，并顯示在窗口下方的黃色框中的百分比。 同樣，吸收光譜重疊（ABOL）和發射光譜重疊（ 易美 ）區域中的紅色和藍色，分別示出，并且也顯示為百分比。 福斯特距離 （如下文所述計算），提出以納米為每個FRET對和上面的應用預置按鈕顯示。 在本教程中，各種捐助的蛋白質可以選擇出現在通道1和受體蛋白的出現在通道2的吸收和發射*大值列出每個通道和紅外光譜分析法或整個通道可以打開或關閉使用復選框。

為了操作的教程，選擇的成像模式（ 廣角或共焦 ），然后使用選擇的光源下拉菜單中選擇合適的照明光源（弧光燈或激光），然后疊加在供體和受體譜。 接下來，點擊應用預置按鈕，激活提示的激發和發射帶通濾波器，以及在二色鏡所選FRET對（ 注：這些值僅作為一個起點確定一個有用的過濾器組合 ）。 該濾波器的通帶區域可以通過平移滑塊或點擊箭頭按鈕對在滑塊的兩端進行調整。 左側的箭頭按鈕對移動整個通帶，而右側的箭頭按鈕對調節寬度。 過濾器可以暫時從窗口中取消相應的復選框（ES）中刪除。 該二色鏡滑塊可用于調整該光學元件的截止波長。 吸收光譜 ， 發射光譜 ， 激發光源 ，和/或二色鏡可打開和關閉與該教程的右側的復選框。 通過捐助方和切換受體使用選擇供體 ，并選擇一個接受器下拉菜單時，使用維護狀態復選框凍結所有設置。 熒光蛋白的光譜類（藍色，青色，綠色，黃色和橙色/紅色）在這些菜單列出可以使用單選按鈕在本教程的上右上角選擇。

在本教程中所示的光譜曲線進行了要么聚集了來自文獻或在使用純化熒光蛋白控制的條件下認真記錄。 它們被歸為比較和顯示的目的。 在實際的FRET調查，光譜曲線可能會有所不同，由于在消光系數，量子產率，探針的濃度，并為各種細胞器和活細胞的細胞質內的局部環境中的*大峰值的值的波動。 因此，在本教程中所提供的信息應被視為被設計僅用于教學目的。 此外，通過本教程的計算福斯特距離也是基于熒光蛋白的出版光譜參數（消光系數，量子產率，波長分布），并與其他文獻值普遍同意。 然而，根據使用來計算的FRET效率的變量，這些值可能不同于在一個實驗設定觀察。

一本教程的目標目的是為了讓游客，探索*佳的照明光源和濾光片組合的具體FRET對。 例如，研究新的青色熒光蛋白，如綠，艾希青色（MiCy）時，該教程是檢驗其在紫色線和藍色紫色光譜區（405到473納米），以確定*大激發效率激光器有用此探測器。 同樣，各個電弧放電燈（水銀，氙和金屬鹵化物）的光譜可以被疊加在供體的吸收光譜相匹配的激發濾波器帶寬和波長分布，可能是容易在實驗室。 本教程也是有效的確定大致的激發和發射光譜擴散到水平的新探頭的組合，而如果過多，可能會在定量分析出現問題。

當熒光蛋白進入激發狀態，由于通過激光或強烈的弧光燈的等離子體源照明，在分子表現為一個振蕩偶極子，并創建特征電場。 在情況下，一個合適的受體熒光蛋白（或其它熒光團）的接近由興奮蛋白（供體）中產生的電場的邊界內放置它，能量可以直接被誘導躍遷電動相互作用傳送來自供體在受體。 中間的光子不參與。 能量轉移的效率是依賴于供體的電場幅度的平方，并且這個字段衰變作為供體和受體之間的距離的倒數第六功率。 福斯特距離表示分子分離在其中能量傳輸是50％的有效率。 對于發生可測量的煩惱，幾個要求必須得到滿足。 其中一個是對供體和受體熒光基團，它僅限于幾個納米之間的物理距離很強的依賴性。 此外，必須有與受體的吸收光譜的供體發射光譜的顯著光譜重疊。 *后，無論是供體和受體分子必須在一個有利的相互取向。

在共振能量轉移的實際應用，實驗生物學的一個關鍵步驟是在福斯特距離（RO）的價值為目標施主-受主對的計算。在此計算中的*重要因素是重疊積分（j（λ）），供體的量子產率在無受體（Q（d）段），和兩分子之間的取向因子（κ;這個變量的平方）。 在本教程中，重疊積分是根據公式計算：

其中，消光系數（ε（λ））被表示為每厘米，波長以納米，并且給體作為波長的函數的歸一化熒光強度倒數摩爾的單位是無量綱的。 重疊積分計算取決于許多變量，包括在熒光發射光譜曲線和供體的量子產率的環境影響。 對于具有高量子產率和受體具有大消光系數供體，該光譜重疊積分會更大，導致更有效的FRET伙伴具有較高滾裝值。 雖然折射率不發生變化，以典型的水性溶劑或蛋白質之間有很大程度，在福斯特距離計算該參數顯示為第四功率的倒數，甚至相對微小的變化可以呈現更大的效果比量子產率或重疊積分。 此外，供體和受體之間的偶極 - 偶極相互作用的效率取決于兩個偶極子的取向。 取向因子，它描述了這樣的接近，范圍從0（兩個偶極子垂直）到4（偶極子平行）。 在一般情況下，該偶極子被認為是快速移動的時間尺度類似于供體激發態壽命，因而取向被描述為隨機的，具有0.67的取向因子（在本教程適用）。 請注意，取向因子近似可導致不確定性分離的基礎上的FRET結果在實際的實驗中兩個熒光基團的距離的估計。